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目的:结直肠癌（colorectal cancer,CRC）是最常见的恶性肿瘤之一,发病率和死亡率均较高。结直肠癌起病较为隐匿,患者早期一般无明显特异性症状,随着病情发展,出现表现为大便习惯改变等非特异性症状,往往容易忽视,导致很多患者就诊时已是中晚期,失去手术根治的机会。若对早期CRC进行临床干预,患者得5年生存率有望达到90%,而一旦肿瘤发生转移,则患者5年生存率仅为14%。结直肠癌发病经过局部粘膜浸润、区域扩散及远端转移等一系列进程,这个多步骤的过程往往也涉及多种基因及信号通路的参与。因此深入研究结直肠癌的发生发展机制,寻找早期诊断的重要分子标志物从而改善结直肠癌患者的预后显得尤为重要。环状RNA（circularRNA,circRNA）是一种不同于线性RNA的非编码RNA,通过外显子或内含子环化在3’和5’末端连接,通过共价键形成完整的环结构,不易被核酸外切酶降解,因此较线性RNA结构更加稳定。CircRNA具有广泛的生物学功能,其与miRNA具有极为丰富的结合位点,因此可以像分子海绵一样通过吸收miRNA起作用。CircRNA还可以通过碱基配对作用于其他RNA,也可以通过与蛋白相互作用来抑制蛋白的活性。另外,尽管circRNA是非编码RNA,但在某些条件下,它可以充当蛋白质合成的翻译模板并产生功能性蛋白。Circ-LECRC是来源于YAP1（Yes1 associated transcriptional regulator）基因转录而来,其另外的转录本circYAP1在胃癌、乳腺癌中已有研究报道,能够抑制肿瘤细胞的增殖及转移,发挥抑癌的作用。MiR-135b-5p是一种microRNA,TCGA数据库及GEO多个芯片数据提示其在肠癌中呈显著高表达趋势。文献报道miR-135b-5p可以通过与KLF4等靶基因的结合,促进结直肠癌的增殖、侵袭、转移等病理过程。KLF4作为真核生物的转录因子,参与调控细胞增殖、分化等重要生理过程。KLF4曾被命名为胃肠富集Krüppel样因子,在结直肠癌中被认为是抑癌基因,其表达在癌组织中明显下调,研究表明KLF4的缺失是结直肠癌患者预后的独立预测因素。通过生物信息学网站预测,miR-135b-5p与circ-LECRC及KLF4的3’UTR均存在结合位点,基于以上理论,我们推测circ-LECRC可能通过内源性竞争结合miR-135b-5p,从而提高KLF4的抑癌作用。本课题拟研究circ-LECRC、miR-135b-5p及KLF4在CRC组织及细胞系中的表达情况,分析其与病理资料及预后的关系,并在体外水平研究circ-LECRC对CRC细胞的恶性生物学影响,进而研究circ-LECRC、miR-135b-5p及KLF4之间作用机制。本课题重点研究circ-LECRC的表达水平与CRC的病理改变及预后的关系,并在CRC细胞系中探索其对肿瘤细胞生物学行为的影响,进而深入地揭示CRC发生发展的分子机制,以期实现CRC的早期诊断和治疗,并改善CRC患者的治疗效果和预后。研究方法:1、环状水平验证及稳定性检测:利用Sanger测序确定circ-LECRC为环状RNA,利用RNase R处理总RNA,qPCR检测表达量,比较处理前后的YAP1线性与环状的稳定性差异。2、Circ-LECRC的在结直肠癌组织及细胞系中的表达差异收集来自中国医科大学附属第一医院结直肠癌手术患者的癌组织和癌旁非癌组织标本,同时培养人源的结直肠癌细胞系:RKO、SW480、HCT116、HT29、SW620、DLD1细胞和正常肠粘膜上皮FHC细胞。通过原位杂交观察circ-LECRC在结直肠癌患者石蜡切片中的表达量,分析其表达量与患者病理资料及预后之间的关系。通过qPCR检测circ-LECRC在新鲜结直肠癌组织中的表达差异,分析其表达量与各病理资料间的关系。通过qPCR检测多种肠癌系及正常肠上皮间的表达差异,筛选用于功能实验的细胞系。3、验证circ-LECRC对肠癌细胞表型的影响向HCT116和SW480细胞转染质粒及慢病毒,构建circ-LECRC稳定过表达和敲减细胞系,并通过转染的方法实现miR-135b-5p、KLF4的过表达和敲减。通过CCK-8实验检测HCT116和SW480细胞的增殖能力;通过Transwell实验检测HCT116和SW480细胞的迁移和侵袭能力;通过流式细胞术检测HCT116和SW480细胞的凋亡和周期。在4-6周Balb/c裸鼠皮下注射过表达circ-LECRC及对照的SW480细胞,监测裸鼠皮下成瘤情况。向裸鼠尾静脉注射过表达circ-LECRC及对照的SW480细胞观察其肺转移情况,体内验证circ-LECRC对SW480细胞增殖及转移能力的影响。4、构建circ-LECRC/miR-135b-5p/KLF4调控网络通过荧光原位杂交（FISH）实验确定circ-LECRC在HCT116和SW480细胞中的定位。再利用生物信息学方法构建circ-LECRC/miR-135b-5p/KLF4调控网络。FISH实验验证circ-LECRC与miR-135b-5p共定位关系。并且利用双荧光素酶实验直接验证circ-LECRC/miR-135b-5p及miR-135b-5p/KLF4之间的结合关系。使用Ago2抗体进行SW480细胞的RNA免疫共沉淀（RIP）,验证circLECRC/miR-135b-5p/KLF4之间的结合关系。5、验证肠癌组织miR-135b-5p及KLF4表达及其与circ-LECRC相关性使用之前检测circ-LECRC表达的同一批新鲜组织提取的RNA,检测miR-135b-5p及KLF4表达,分析circ-LECRC与miR-135b-5p、miR-135b-5p与KLF4、circ-LECRC与KLF4之间表达的相关性,进一步明确其调控关系。6、进一步探讨circ-LECRC/miR-135b-5p/KLF4作用轴的调控关系通过RIP实验,使用Ago2抗体富集circ-LECRC及KLF4,检测过表达circLECRC及NC组的SW480细胞中circ-LECRC与KLF4的调控变化。分别过表达及敲减circ-LECRC的HCT116和SW480细胞中,Western Blot检测靶基因KLF4的表达变化。7、circ-LECRC/miR-135b-5p/KLF4作用轴对肠癌细胞生物学行为的影响CCK8、Transwell侵袭及迁移实验对circ-LECRC/miR-135b-5p/KLF4之间进行功能回复,验证circ-LECRC/miR-135b-5p/KLF4作用轴的竞争性结合关系。结果:1、通过测序及比对,发现并验证了YAP1在结直肠癌中新的circRNA转录本,并且证实环状RNA的稳定性。2、circ-LECRC在组织中的表达量与结直肠癌患者的年龄、性别、肿瘤位置、肿瘤大小及肿瘤远端转移无关。表达水平肿瘤浸润深度、淋巴结转移、TNM分期呈负相关。且circ-LECRC的表达与结直肠癌患者预后呈负相关。与正常上皮FHC相比,circ-LECRC在RKO、HCT116、HT29、SW480、SW620细胞中表达均较低。3、CCK8实验显示在HCT116和SW480细胞中,过表达circ-LECRC可以抑制肠癌细胞的增殖能力,敲减circ-LECRC可以增强肠癌细胞的增殖能力;Transwell实验显示在HCT116和SW480细胞中,过表达circ-LECRC可以抑制肠癌细胞的迁移及能力,相反敲减circ-LECRC可以增强肠癌细胞的迁移及侵袭能力;同样在HCT116和SW480细胞中,过表达circ-LECRC可以促进肠癌细胞凋亡,而敲减circ-LECRC能够抑制肠癌细胞凋亡。裸鼠成瘤实验中,过表达circ-LECRC组瘤体增长速度与最终重量较对照组小;肺转移实验中,过表达circ-LECRC组裸鼠肺转移灶较小且少。4、FISH实验验证circ-LECRC与miR-135b-5p均主要在SW480细胞质中表达。且网站预测miR-135b-5p与circ-LECRC的9号位点结合,与KLF4的924号位点结合。双荧光素酶实验验证miR-135b-5p与circ-LECRC及KLF4均存在结合,RIP实验进一步证实Ago2抗体可下拉circ-LECRC和KLF4。5、miR-135b-5p在肠癌组织中呈显著高表达,KLF4在肠癌组织中高表达。且circ-LECRC与miR-135b-5p表达呈负相关,miR-135b-5p与KLF4表达呈负相关,circ-LECRC与KLF4表达呈正相关。6、Western Blot实验证实,在HCT116和SW480细胞中,过表达circ-LECRC,KLF4蛋白表达水平提高,相反,敲减circ-LECRC则KLF4蛋白表达水平降低。RIP中使用Ago2抗体富集circ-LECRC及KLF4,过表达circ-LECRC的SW480细胞中富集到的circ-LECRC增多,KLF4减少。7、CCK8及Transwell迁移、侵袭实验结果显示,circ-LECRC是通过竞争性结合miR-135b-5p来调控KLF4的表达,进而对肠癌细胞的生物学特性产生影响。结论:在结直肠癌中首次发现YAP1基因来源的变异环状RNA转录本（circLECRC）。证实circ-LECRC在结直肠癌组织中低表达,且低表达水平与肿瘤浸润深度、淋巴结转移、TNM分期及预后密切相关。circ-LECRC通过竞争性结合miR-135b-5p来调控KLF4的表达,抑制肿瘤细胞增殖、侵袭、迁移,促进细胞凋亡。