【摘 要】
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角质细胞生长因子-1(Keratinocyte growth factor-1,KGF-1)对人和动物的多种上皮细胞具有特异性,可诱导角质细胞增殖、迁移和分化,对伤口具有修复作用而无不良炎症反应。人角质细胞生长因子(Human keratinocyte growth factor-1,hKGF-1)可降低人的恶性肿瘤治疗中由高剂量化学疗法和放射疗法引起的黏膜炎的发生率和持续时间。天然的人角质细胞因
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角质细胞生长因子-1(Keratinocyte growth factor-1,KGF-1)对人和动物的多种上皮细胞具有特异性,可诱导角质细胞增殖、迁移和分化,对伤口具有修复作用而无不良炎症反应。人角质细胞生长因子(Human keratinocyte growth factor-1,hKGF-1)可降低人的恶性肿瘤治疗中由高剂量化学疗法和放射疗法引起的黏膜炎的发生率和持续时间。天然的人角质细胞因子hKGF-1产量低和稳定性差,因而难以满足市场需求,所以急需一种高效的表达方法。水稻种子具有完整的真核表达系统,利于外源蛋白的表达、翻译后加工、积累和稳定,易于运输,因此利用水稻种子表达hKGF-1容易得到高表达的植株,成本低,可为hKGF-1的下游加工及临床应用创造条件。本研究从玉米中克隆了种子特异性启动子pGBSSI,研究明确了其转录活性,并利用该启动子驱动目的基因人角质细胞生长因子(hKGF-1)的表达,旨在获得高表达hKGF-1的水稻材料。本研究可为获得表达量高、天然安全的hKGF-1提供新途径,主要获得以下研究成果:(1)从玉米基因组中克隆了大小为999bp的种子特异性启动子pGBSSI,序列分析显示GBSSI基因启动子含有一个CpG岛及多种顺式作用元件如光响应、胁迫响应、激素响应、胁迫诱导和发育元件。构建了植物表达载体pCBG-Gus并利用农杆菌转化玉米幼胚,通过筛选和分化获得抗性玉米植株,Bar基因金标免疫试纸检测,结合PCR检测获得了转基因植株。qPCR结果显示Gus基因在叶片中相对表达水平最高,Gus组织化学染色结果显示玉米成熟籽粒中表达量最高,而其它组织中未检测到或表达量较低,说明在籽粒成熟过程中Gus蛋白在籽粒中逐渐积累,可用于在禾本科植物中表达外源蛋白。(2)根据水稻密码子的偏好性,优化并人工合成了人角质细胞生长因子(hKGF-1)的基因序列,并在5’端添加多聚组氨酸(His-Tag)序列用于重组蛋白的纯化;构建了种子特异性表达载体pCBG-hKGF1。利用农杆菌介导法将种子特异性表达载体pCBG-hKGF1转化水稻日本晴的愈伤组织,通过筛选和分化获得了 233株抗性再生苗。(3)目的基因PCR检测结合bar基因的金标免疫试纸条检测,共得到46个水稻转化事件。DNA分子杂交(Southern Blotting)检测共得到了 12个hKGF-1单拷贝插入水稻基因组的转化事件。RT-PCR结果显示,在12个转化事件中hKGF-1得到转录。免疫印迹(Western Blotting)检测结果显示,在10个转化事件中hKGF-1得到了表达。免疫酶联检测(ELISA)结果显示水稻来源的hKGF-1蛋白的表达量最高可达到10.8μg/g糙米。利用Ni+亲和层析纯化了水稻来源的hKGF-1蛋白,并对其促有丝分裂活性进行了检测。结果显示水稻来源的hKGF-1能够促进小鼠3T3纤维母细胞的增殖,并且在浓度为1ng/mL至75ng/mL之间,细胞增殖速率与水稻来源的hKGF-1浓度呈线性正相关。在此线性范围内,给药5ng时,水稻来源的hKGF-1(OshKGF-1)蛋白与商业化标准hKGF-1蛋白具有等同活性。
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