目的:不良妊娠结局是全球产科重点关注的问题之一。以往流行病学研究报道与不良妊娠结局相关的因素很多,如孕妇生活方式、饮食、感染性疾病等。随着社会工业化飞速发展,环境中金属浓度越来越高,对人类健康的影响也愈发严重。由于孕妇及胎儿免疫力较弱,对外界环境敏感性较强,环境中金属暴露对胎儿的影响较为显著。有流行病学研究报道,孕妇金属暴露与不良妊娠结局有关,但以往研究大多局限于一种或者几种金属,忽略了金属复合暴露对不良妊娠结局的影响。环境中的金属大多以两种或者两种以上复合暴露于人体,并且金属之间存在交互作用,尤其是浓度水平较低时,单个金属暴露虽然不会引起明显的健康效应,但多个金属复合暴露可能会产生较强的毒物效应。随着基因芯片技术的推广,近几年与不良妊娠结局相关的全基因组外显子多态性分析的报道逐渐增多,尤其是早产、妊娠期糖尿病等。然而关于单胎足月新生儿出生体重相关的全基因组外显子多态性的研究并不多见。因此,本研究基于广西出生队列(Guangxi Birth Cohort Study,GBCS)数据库及人类全基因组外显子芯片技术的全基因组关联分析数据(Genome-Wide Analysis,GWAS),分析孕妇血清单金属及多金属复合暴露与不良妊娠结局的关系,并从遗传学角度分析与单胎足月新生儿出生体重相关的孕妇基因多态性,并根据生物信息学知识对相关位点进行分析,旨在为不良妊娠结局的预防提供科学有效的参考依据。方法:1.孕妇血清金属与三种不良妊娠结局的关系:(1)研究设计及研究对象的选择:采用前瞻性队列研究,选取2015年7月-2016年6月在广西八家医院产检并分娩的孕妇5541人,应用巢式病例对照研究设计,根据分娩医院、孕妇年龄、纳入孕周及胎儿性别按照1:2进行匹配,共筛选出低出生体重248人,对照组496人;巨大儿131人,对照组262人;早产206人,对照组412人。由于血清样本量不足,最后纳入研究对象为:低出生体重246人,对照组409人,巨大儿131人,对照组260人,早产201人,对照400人。(2)生物样本检测:应用电感耦合等离子体质谱仪(Inductive Coupled Plasma Mass Spectrometer,ICP-MS)检测孕妇血清22种金属浓度。(3)统计分析:①应用Logistic回归分析、分层分析、限制立方回归分析(Restrict Cubic Analysis,RCS)计算孕妇血清金属与不良妊娠结局之间的相关关系及剂量反应关系;金属浓度在Logistic回归分析中应用四分位浓度,在剂量反应关系中应用连续变量。②应用弹性网络回归筛选与不良妊娠结局相关的金属,并结合Logistic回归构建多金属复合暴露模型,分析多金属复合暴露与不良妊娠结局之间的关系。2.孕妇基因多态性对新生儿出生体重的影响:(1)研究设计及研究对象的选择:本研究按照极端表型原则,选择已完成血清金属浓度检测的孕妇及其新生儿为研究对象,以单胎足月新生儿出生体重为结局变量,其中单胎足月新生儿体重最低的103人,根据分娩医院、纳入孕周、孕妇年龄、胎儿性别按照1:1匹配,筛选正常出生体重103人。基于数量性状位点的全基因组外显子芯片技术,分析孕妇基因多态性与新生儿出生体重的相关性。(2)样本检测:应用全基因组外显子芯片(Infinium Asian Screening Array-24 V 1.0)对206名孕妇外周血进行全基因组外显子多态性研究。(3)统计分析:①应用多元线性回归分析与单胎足月新生儿出生体重相关的基因位点,并对有统计学意义的位点进行筛选(P<4×10-5)。②应用NCBI、Seattle Seq Annotation 151、Ensemble、Genome Brower 94、UniProt、DAVID、KEGG等数据库及网站进行生物信息学分析,筛选与单胎足月新生儿出生体重相关的有生物学意义的位点,并对其进行GO分析及KEGG信号通路分析。③在本论文第一部分数据分析的基础上,应用广义线性回归分析血清钴、钛、钼与单胎足月新生儿出生体重的相关关系。④应用Plink软件分析孕妇血清金属和基因的交互作用对单胎足月新生儿出生体重的影响。结果:1.孕妇金属暴露对低出生体重的影响:(1)基线资料:低出生体重组和对照组除孕妇妊娠前BMI、新生儿体重、身长、头围及胸围差异有统计学意义(所有的P值均小于0.05)外,其他基线资料差异均无统计学意义(所有的P值均大于0.05)。(2)单模型Logistic回归分析显示:孕妇较低浓度的血清钴(0.41-0.74μg/L)是低出生体重发生的危险因素、较低浓度的血清钛(10.63-12.06μg/L)、较低浓度的血清钼(0.91-1.07 μg/L)均是低出生体重发生的保护性因素(Co:Q3 vs Q4:Adjusted OR=1.80,95%CI:1.14-2.84,P trend=0.033;Ti:Q2 vs Q4:Adjusted OR=0.49,95%CI:0.31-0.78,P trend=0.040;Mo:Q2 vs Q4:Adjusted OR=0.47,95%CI:0.30-0.75,P trend=0.009)。分层分析结果显示,三种金属的敏感期均为妊娠孕周>13周。当孕妇年龄>28岁,婴儿性别为女,较低浓度的血清钛(10.63-12.06 μg/L)与低出生体重发生风险的关联均较明显;孕妇年龄≤28岁,婴儿性别为男,较低浓度的血清钴(0.41-0.74 μg/L)与低出生体重发生风险的关联均较明显。较低浓度的血清钼(0.91-1.07 μg/L)在孕妇年龄及婴儿性别各分层中均是低出生体重的保护性因素。(3)剂量反应关系:孕妇血清钛和血清钴与低出生体重儿发生风险均存在非线性剂量反应关系(Ti:P for overall=0.015,P for nonlinearity=0.008;Co:P for overall=0.048,P for nonlinearity=0.014)。当孕妇血清钛>12.20 μg/L,血清钴<0.38 μg/L,低出生体重风险性均升高。(4)金属交互作用:高浓度的血清钼(>1.08 μg/L)和低浓度的血清钛(≤12.06μg/L)交互作用是低出生体重发生的保护因素(OR=0.48,95%CI:0.30-0.78,P=0.004),且分层分析结果显示妊娠孕周>13周,孕妇年龄>28岁,婴儿性别为女,这种关联均较显著。(5)金属复合暴露模型:应用弹性网络回归筛选与低出生体重发生风险相关的 14 个金属(Mg,Ti,V,Cr,Fe,Co,Ni,Zn,Se,Rb,Sr,Mo,Sn 和 Sb)并构建复合暴露模型,结果显示较低浓度的血清钛、锌、钼是新生儿低出生体重生的保护因素(Ti:Q2 vs Q4:OR=0.44,95%CI:0.25-0.78.Mo:Q2 vs Q4:OR=0.42,95%CI:0.25-0.72;Zn:Q2 vs Q4:OR=0.50,95%CI:0.29-0.87)。低浓度的血清镁、钴是新生儿低出体重发生的危险因素(Mg:Q3 vs Q4:OR=1.11,95%CI:1.15-3.86;Co:Q3 vs Q4:OR=1.52,95%CI:1.44-4.43)。2.孕妇金属暴露对巨大儿的影响:(1)基线资料:巨大儿组和对照组除孕妇妊娠前BMI、受教育程度、产次、新生儿体重、身长、头围、胸围差异有统计学意义(所有的P值均小于0.05),其他基线资料差异均无统计学意义(所有的P值均大于0.05)。(2)单模型Logistic回归分析显示,较高浓度血清钙(>121.20 mg/L)、较高浓度血清钒(0.65-0.92 μg/L)、较高浓度血清钼(0.89-1.45 μg/L)均是巨大儿发生的风险因素(Ca:Q4 vs.Q1:Unadjusted OR=2.13,95%CI:1.17-3.89,P trend=0.004;V:Q3 vs.Q1:Adjusted OR=2.95,95%CI:1.50-5.83,P trend=0.082;Mo:Q2 vs Q1:Adjusted OR=2.15,95%CI:1.04-4.46;Q3 vs Q1:Adjusted OR=2.10,95%CI:1.02-4.30,Ptrend=0.113),较高浓度血清钛(10.81-12.07 μg/L)是巨大儿发生的保护性因素(Q2 vs Q1:Adjusted OR=0.44,95%CI:0.20-0.97,Ptrend=0.113)。分层分析结果显示,孕妇年龄≤28岁,较高浓度血清钒(0.65-0.92 μg/L)、较高浓度的血清钼(0.89-1.45μg/L)均与巨大儿发生风险关联性较强;孕妇>28岁,校正的较高浓度血清钛(10.81-12.07 μg/L)和未校正的较高浓度的钙(>121.20 mg/L)与巨大儿发生风险关联性较强。(3)剂量反应关系:孕妇血清钒与巨大儿发生风险存在非线性剂量反应关系(P for overall=0.014,P for nonlinearity=0.047)。当血清钒钒>0.70μg/L,巨大儿发生风险逐渐下降。(4)金属交互作用:高浓度的钙(>114.48 mg/L)、钛(>12.07μg/L)、钒(>0.65 μg/L)、钼(>1.08 μg/L)两两交互作用均是巨大儿发生的风险因素(All P<0.05)。(5)金属复合暴露模型:应用弹性网络回归筛选出与巨大儿发生风险相关的8个金属(Ca,V,Fe,Ni,Mo,Sn,Sb和Ba)并构建金属复合暴露模型,结果显示较高浓度的血清钒(0.65-0.92 μg/L)是巨大儿的危险因素(OR=2.79,95%CI:1.29-6.01,P=0.009)。3.孕妇金属暴露对早产的影响:(1)基线资料:早产组和对照组除新生儿出生体重、身长、头围、胸围差异均具有统计学外(所有的P<0.05),其他基线资料差异均无统计学意义(所有的P>0.05)。(2)单模型Logistic回归分析显示:较高浓度的血清铁、较高浓度的血清銣均是早产发生的保护因素(Fe:Q3 vs Q1:Adjusted OR=0.57,95%CI:0.35-0.93;Q4 vs Q1:Adjusted OR=0.53,95%CI:0.32-0.86,P trend=0.004;Rb:Q4 vs Q1:Adjusted OR=0.36,95%CI:0.59-0.99,P trend=0.057);较高浓度的孕妇血清砷是早产发生的危险因素(Q2 vs Q1:Adjusted OR=1.62,95%CI:1.02-2.08,Ptrend=0.576)。分层分析结果显示,妊娠孕周>13周、孕妇年龄≤ 28岁、婴儿性别为女,高浓度的孕妇血清铁(>1.78 mg/L)均是早产发生的保护性因素。妊娠孕周>13周,孕妇年龄>28岁,校正的高浓度的孕妇血清铷(>333.46 μg/L)均是早产发生的保护性因素。在妊娠孕周≤13周、婴儿性别为男,校正的较高浓度的孕妇血清砷(>0.59μg/L)均是早产发生的危险因素。(3)剂量反应关系:孕妇血清铁与早产发生风险存在线性剂量反应关系(P for overall=0.044,P for nonlinearity=0.249),随着孕妇血清铁浓度升高,早产发生的风险性下降。(4)金属交互作用:高浓度的孕妇血清铁(>1.45 mg/L)和低浓度的孕妇血清砷(≤0.80μg/L)、高浓度的孕妇血清铁(>1.45 mg/L)和低浓度的孕妇血清铷(≤280.27μg/L)、高浓度的孕妇血清铁(>1.45 mg/L)和高浓度的孕妇血清铷(>280.27 μg/L)交互作用,均是早产发生的保护性因素。分层分析结果显示,以上交互作用与早产发生风险关联的敏感期均为妊娠孕周>13周。孕妇年龄>28岁、婴儿性别为男,高浓度的孕妇血清铁(>1.45 mg/L)与低浓度的孕妇血清砷(≤0.80 μg/L)交互作用是早产发生的保护因素;孕妇年龄≤28岁、婴儿性别为女,高浓度的孕妇血清铁(>1.45 mg/L)与低浓度的孕妇血清铷(≤280.27 μg/L)交互作用是早产发生的保护性因素;高浓度的孕妇血清铁(>1.45 mg/L)和高浓度的孕妇血清铷(>280.27μg/L)交互作用在孕妇年龄及胎儿性别分层分析中与早产发生风险没有统计学关联(P>0.05)。(5)金属复合暴露模型:应用弹性网络回归筛选与早产发生风险相关的6个元素(Ti,Fe,Co,Zn,Se,Rb)并构建金属复合暴露模型,结果显示,孕妇高浓度的血清铁(1.45-1.78 mg/L)是早产发生的保护性因素(OR=0.49,95%CI:0.28-0.83,P=0.008);孕妇高浓度的血清锌(>0.88)是早产发生的危险性因素(OR=1.84,95%CI:1.03-3.29)。4.孕妇基因对新生儿出生体重的影响:(1)基线资料:进行全基因组外显子芯片分析的孕妇平均年龄28.29 ±4.42岁,妊娠前BMI平均值为20.18 ± 3.14 Kg/m2,新生儿平均出生体重为 2778.9±556.5 g,体重范围 1800 g-4000 g。平均身长:48.81 ± 2.50 cm,平均头围:31.78±1.93 cm,平均胸围:31.35±2.28 cm。(2)芯片数据分析及生物信息学分析:①根据GWAS数据分析结果,筛选P<5×104的基因位点。②应用OVID网站对与单胎足月新生儿出生体重相关的孕妇基因,从细胞成分、分子功能及参与的生物学过程进行GO功能分析,并应用Cytoscape软件绘制GO分析图。结果显示,筛选基因参与的分子功能主要有转录辅助活性、磷酸二酯水解酶活性、磷脂酶C活性等;参与的生物学过程主要是蛋白代谢过程的正向调控、蛋白质的正向修饰、DNA、RNA代谢及转录的正向调控、细胞生物合成的正向调控等。③对其进一步进行生物信息学分析发现,与足月新生儿出生体重相关的基因有17个(17个位点),均与蛋白质合成有关,分别是:ATF6(rs10918270),CAVIN2(rs9789700),GALNT14(rs75732705),MATN3(rs6728440),PLCH1(rs13100610),PLAGL1(rs9373401),NCAPG2(rs78039900),INVS(rs34505550),GLIS3(rs144576834),PARG(rs3844492),GRID1(rs186666792),TUB(rs143443020),XP04(rs71424096),NDFIP2(rs1417673),TRIP4(rs749504),ARHGAP44(rs2051975),ZNF407(rs373115608)。其中 4个基因(4个位点)还与离子转运体有关,MATN3是钙离子转运体易感基因,GLIS3,TRIP4,ZNF407均是锌离子转运体易感基因。④将与蛋白合成相关的基因应用KEGG网站进行信号通路分析,发现与单胎足月新生儿出生体重相关的通路主要有3条:PLCH1基因(位点:rs13100610)参与的磷酸肌醇代谢相关通路;ATF6基因(位点:rs109182 70)参与的内质网蛋白合成相关通路及INVS基因(位点:rs34505550)参与的Wnt信号通路。(3)孕妇血清金属与新生儿出生体重的相关性分析:广义线性回归分析显示,在校正孕妇年龄、纳入孕周、妊娠前BMI、妊娠期间被动吸烟、妊娠前饮酒等相关因素后,孕妇血清钴与单胎足月新生儿出生体重相关(P<0.05),血清钛和血清钼与足月新生儿出生体重没有统计学关联(所有的P值均大于0.05)。(4)基因与环境交互作用分析:将与单胎足月新生儿出生体重相关的血清钴及基因位点进行交互作用分析,在校正妊娠前BMI、孕妇年龄、纳入孕周等变量后,基因TUB(SNP:rs143443020.)与血清钴的交互作用对单胎足月新生儿出生体重有影响,P interaction-0.026。结论:本研究发现:(1)孕妇血清钛、钴及钼与低出生体重发生风险性存在非线性剂量反应关系,当血清钛浓度>12.20 μg/L,血清钴<0.38 μg/L,低出生体重风险性均升高。(2)孕妇血清钙、钒和钼与巨大儿发生风险性相关,且孕妇血清钒与巨大儿发生的风险性存在非线性剂量反应关系,当血清钒浓度>0.70 μg/L时,巨大儿风险性升高。(3)孕妇血清铁、砷、铷与早产发生风险相关,其中血清铁与早产发生风险存在线性剂量反应关系,随着铁浓度的升高,早产风险性下降。(4)经弹性网络回归筛选与不良妊娠结局相关金属构建的多金属复合暴露模型,校正纳入模型的其他金属及人口学特征后,血清钛、钼及钴与低出生体重发生风险相关;血清钒与巨大儿发生风险相关;血清铁与早产发生风险相关。(5)与足月新生儿出生体重相关的孕妇17个基因均与蛋白质合成有关,其中4个基因还与离子转运体有关。参与的信号通路主要有3条:磷酸肌醇代谢、内质网蛋白合及Wnt信号通路。血清钴与单胎足月新生儿出生体重相关,且孕妇TUB基因(位点:rs143443020)与血清钴的交互作用对单胎足月新生儿出生体重有影响。