骨肉瘤是原发于骨组织的最常见的恶性肿瘤,恶性程度高,好发于儿童及青少年。目前主要采用新辅助化疗加保肢治疗,疗效比以前有很大的改进,五年生存率由原来的不足20%上升到60%～70%,但仍有25%~30%的患者复发或转移,威胁着患者的生命。明确骨肉瘤发生发展的机制、有效控制复发和转移等,是目前需要深入研究的课题。骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins, BMPs)是转化生长因子β(Transforming growth factorβ,TGFβ)超家族的成员之一,最初因为其能诱导骨和软骨的形成而得名。后来的研究发现,除诱导成骨外,BMPs对多个系统的形成和发育均有影响,如BMP2在心脏形成中起作用,BMP7与肾形成有关,多种BMPs在生殖器官的形成中起特定作用。近来的研究发现,BMPs对多种肿瘤也有不同的生物学作用,例如BMP2能增强前列腺癌细胞的活动能力,BMP4抑制多发性骨髓瘤的增殖,诱导其凋亡。接受BMPs调节的肿瘤还包括肺癌、胃癌、乳腺癌、前列腺癌、神经胶质瘤、骨肉瘤等。为进一步阐明BMPs家族对骨肉瘤的作用,本研究选择该家族中的两个成员BMP2和BMP9,通过重组腺病毒介导基因转入的方式在体外研究它们对人骨肉瘤细胞株MG63、U2OS和143B的增殖、凋亡、迁移的作用及对Wnt/β-catenin信号途径的关键信号分子β-catenin的影响;同时用143B构建裸鼠皮下移植瘤模型,探讨hBMP2和9对人骨肉瘤的体内作用。整个研究分为三大部分,实验设计、方法和研究结果如下:1.用免疫细胞化学法(Immunocytochemistry,ICC)和Western blot检测hBMP2和9在人骨肉瘤细胞株MG63、U2OS和143B中的表达1.1内源性表达:实验发现在这三株人骨肉瘤细胞中均有不同程度的hBMP2和9表达,且两种方法的结果一致;ICC显示hBMP2和9的表达部位主要在胞浆。1.2重组腺病毒AdBMP2(Adenovirous-BMP2)和AdBMP9(Adenovirous-BMP9)感染MG63、U2OS和143B:72 h后,表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的细胞达80%～90%,提示病毒感染效率较高;ICC检测发现感染后的细胞中相应hBMP2或hBMP9在胞浆中表达增加,在胞核也有表达;经Image Pro Plus (IPP)图象分析软件分析ICC图片的IOD值,AdBMP2感染后hBMP2在MG63、U2OS和143B中的IOD值分别为实验对照组的1.27倍、2.64倍和1.98倍;AdBMP9感染后BMP9在MG63、U2OS、143B中的IOD值分别为AdGFP组的1.36倍、3.06倍和2.12倍。Western blot检测发现,感染后细胞的相应hBMP的反应条带增粗。经Quantity-one 4.31软件分析,MG63、U2OS和143B细胞的AdBMP2组的BMP2反应条带灰度值分别为相应AdGFP组的1.41倍、1.97倍和1.34倍;各AdBMP9组的BMP9反应条带的灰度值分别为各AdGFP组的1.43倍、1.50倍和1.48倍。这两种方法均一致地表明重组腺病毒携带的目的基因在靶细胞中成功表达。2.体外实验:2.1实验分组如下:①空白对照组:未做处理的骨肉瘤细胞株MG63、U2OS和143B;②实验对照组:AdGFP感染的骨肉瘤细胞株,即AdGFP-MG63组、AdGFP-U2OS组和AdGFP-143B组;③实验组:AdBMP2和9分别感染的骨肉瘤细胞株,即AdBMP2-MG63组、AdBMP2-U2OS组、AdBMP2-143B组和AdBMP9-MG63组、AdBMP9-U2OS组、AdBMP9-143B组。2.2实验方法:分别用四氮唑盐比色法(MTT Cell Proliferation Assay,MTT法)和台盼兰拒染活细胞计数法、Hoechst/PI染色法、划痕愈合法(wound healing assay)检测外源性hBMP2和9对人骨肉瘤细胞株MG63、U2OS和143B增殖、凋亡、迁移的影响,并用免疫细胞化学法和Western blot检测各组骨肉瘤细胞中β-catenin水平的变化。2.3结果:1)外源性hBMP2和9对人骨肉瘤细胞株MG63、U2OS和143B增殖的影响MTT法:AdBMP2和9感染后,所有实验组的细胞在570 nm处的吸光度值(A570)在72 h内随时间延长均逐渐降低,而两个对照组的A570均随时间延长逐渐升高。以MG63为例,AdBMP2和9组在24、48和72 h的吸光度值分别为AdGFP组的76.9%、82.3%、53.6%,81.4%、78.8%、46.9%。各实验组与各对照组的差异具有显著性(P<0.01),各空白对照组与相应实验对照组间的差异无显著性(p>0.05)。台盼兰拒染法:其结果与MTT法一致。提示:外源性的hBMP2和hBMP9对这三株人骨肉瘤细胞的增殖具有抑制作用。2)外源性hBMP2和9对人骨肉瘤细胞株MG63、U2OS和143B凋亡的影响①Hoechst/PI双染后,荧光显微镜观察并计数凋亡细胞。②细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期:Ⅰ期的细胞核呈波纹状(rippled)或呈折缝样(creased),部分染色质出现浓缩状态;Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化;Ⅱb期的细胞核裂解为碎块,产生凋亡小体。③三株细胞中,AdBMP2组和AdBMP9组的凋亡率均随着时间延长而逐渐增高,与实验对照组的差异具有显著性(p<0.01),而各相应对照组之间的凋亡率差异无统计学意义。以143B为例,在24、48和72 h三个时间点,AdBMP2组的凋亡率分别为AdGFP组的1.64倍、2.49倍、2.87倍,AdBMP9组的凋亡率分别为AdGFP组的1.48倍、2.95倍、2.67倍。提示外源性hBMP2和9能诱导MG63、U2OS和143B的凋亡。3)外源性hBMP2和9对人骨肉瘤细胞株MG63、U2OS和143B迁移的影响①MG63:划痕后24 h,空白组和AdGFP组划痕全部愈合,而AdBMP2组和AdBMP9组划痕愈合率分别为47.5%和34.1%。②U2OS:划痕后72 h,空白组和AdGFP组划痕全部愈合,而AdBMP2组和AdBMP9组划痕愈合率分别为23.7%和43.1%。③143B :空白组和AdGFP组划痕均在20 h时完全愈合时,实验组的划痕仍明显,即AdBMP2和9处理组的143B细胞的划痕愈合速度明显慢于对照组,愈合率分别为40.2%和26.2%。④MG63、U2OS和143B三株细胞空白组划痕愈合的时间分别为24、72和20 h。提示外源性hBMP2和9能够抑制这三株人骨肉瘤细胞的迁移;比较这三株细胞的迁移速度,143B最快,MG63次之,U2OS最慢。4)外源性hBMP2和9对人骨肉瘤细胞株MG63、U2OS和143B中信号分子β-catenin的影响①ICC结果:MG63:空白组和AdGFP-组β-catenin均呈强阳性表达,即胞浆中有大量棕黄色颗粒堆积,胞核中也有少量表达。AdBMP2组和AdBMP9组中β-catenin呈阳性表达,但是阳性程度明显弱于相应的对照组。IPP图象分析软件分析示AdBMP2组和AdBMP9组的光密度值是相应的AdGFP组的24.1%、29.8%,差异具有显著性(p<0.01);空白组与AdGFP组间的差异无显著性(p>0.05)。U2OS和143B的ICC结果与MG63类似。②Western blot结果:与ICC一致。以143B为例,AdBMP2组和AdBMP9组在感染24 h时灰度值分别分AdGFP组的36.2%和52.8%。提示hBMP2和9可下调这三株骨肉瘤细胞中β-catenin的水平。3.体内实验:3.1实验设计:用人骨肉瘤细胞株143B构建裸鼠皮下移植瘤模型,实验组中分别用AdBMP2和9感染143B细胞后约24 h,感染效率约40%～50%时接种于裸鼠皮下,观察其成瘤情况;通过与AdGFP组和空白组的成瘤情况对比,从而探讨hBMP2和9对人骨肉瘤的体内作用。3.2结果:1)从肿瘤生长曲线来看,空白组和AdGFP组肿瘤生长迅速,两个实验组的肿瘤生长较缓慢。2)细胞接种60天时,空白组、AdGFP组、AdBMP2组和AdBMP9组的瘤体体积分别为:3141±1488mm3、3475±1544mm3、1116±1200mm3和582±400mm3,空白组与AdGFP组间差异无显著性(p>0.05),AdBMP2组和AdBMP9组与对照组的差异均极具显著性(p<0.01)。提示外源性hBMP2和9在体内具有抑制人骨肉瘤生长的作用,这与第二部分的体外实验结果——外源性hBMP2和9在体外对骨肉瘤细胞的抑制作用是一致的。综上所述,本课题研究了hBMP2和9在人骨肉瘤细胞株中的内源性表达、外源性hBMP2和9对人骨肉瘤细胞株MG63、U2OS和143B体外的增殖、凋亡、迁移和信号分子β-catenin的影响以及它们的体内作用。主要研究结论如下:1.BMP2和9在骨肉瘤细胞株MG63、U2OS和143B均有内源性表达。2.在体外,外源性hBMP2和9能不同程度地抑制三种骨肉瘤细胞株的增殖和迁移,促进其凋亡,并下调细胞中β-catenin的水平。提示hBMP2和9在体外具有抑制骨肉瘤细胞的生物学活性;其对Wnt/β-catenin信号途径关键分子β-catenin的下调可能是介导其抑制作用的机制之一。3.用143B构建的裸鼠皮下移植瘤模型生长较迅速,且裸鼠存活时间约为两个月,适于骨肉瘤的在体研究。4. hBMP2和9在体内能明显抑制骨肉瘤的生长。综上,该课题比较系统地探讨了hBMP2和9对骨肉瘤的体内外作用,为阐明它们对骨肉瘤的生物学作用、可能机制以及它们在骨肉瘤发生发展中的作用积累了实验依据,也为寻找骨肉瘤治疗的新靶点提供了线索。