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背景与研究目的毛囊干细胞(Hair follicle stem cells,HFSCs)的发现及体外培养,为研制新型组织工程皮肤治疗在临床上烧伤创伤导致的皮肤缺损,提供了新的思路和方法。目前研究认为HFSCs定位于毛囊外根鞘的隆突区,大致是毛囊外根鞘最外层靠近立毛肌附着点处。HFSCs是具有多向分化潜能、自我复制、高度增殖能力等特点的多能干细胞,并且是分化为特定类型如表皮、毛囊和皮脂腺等的细胞来源。在维持毛囊周期以及组织形成过程中,HFSCs发挥重要作用。毛囊周期处于静息状态时,细胞呈慢周期性;在外来信号刺激下,则表现出很强的增殖潜能力和克隆形成能力,是上皮各类干细胞中最具增殖潜力的干细胞库。本课题探讨中采用酶消化法得到完整的毛囊,根据毛囊形态特征和解剖结构,在体外显微分离毛囊隆突区,成功地获得高纯度、有活性的人HFSCs,进行细胞原代和传代培养,为深入研究HFSCs生理功能及调节分化机制奠定了基础。研究表明,HFSCs的增殖分化受到自身基因及外来信号的共同作用。Wnt/β-catenin信号通路在毛囊毛发发育中起重要作用。在胚胎发育和肿瘤发生中,Wnt蛋白与相应受体结合将启动该信号途径,引起β-catenin在胞浆内的堆积,随之转入到细胞核中,并与LEFl结合激活下游靶基因,促进毛囊干细胞定向分化。其他因素如化学物质(氯化锂等)、细胞生长因子等众多因素能使HFSCs胞浆内β-catenin水平改变,使HFSCs向着不同方向分化,但具体机制有待进一步研究。本课题探讨以角质细胞生长因子(KGF)及氯化锂(LiCl)干预下,Wnt/β-catenin信号通路在人HFSCs向毛囊乳突细胞或表皮细胞定向分化中的作用及与其他信号因子的相互关系,以及药物控释系统在组织工程皮肤中的应用。本实验从以下几个方面开展研究:方法1.采用酶消化法和显微分离法获取毛囊隆突区干细胞,进行原代培养。并以1×10~3/ml、1×10~4/ml、1×10~5/ml及1×10~6/ml接种密度体外培养人HFSCs,观察细胞生长情况,用Hoechst方法检测其生长曲线,观察各密度培养的HFSCs在不同时间点的增殖效应;使用免疫荧光染色法对毛囊干细胞及其分化细胞进行鉴定。筛选出体外最佳的HFSCs传代培养密度。2.分别选用以0mmol/L、0.5mmol/L、1.5mmol/L、10mmol/L、25mmol/L的氯化锂(LiCl)以及0ug/L、10ug/L、25ug/L、50ug/L、100ug/L浓度梯度的角质细胞生长因子(KGF)诱导毛囊干细胞分化,Hoechst方法检测对比分析各组对细胞增殖效应;探索促HFSCs分化的最佳LiCl及KGF浓度。使用RT-PCR检测对照组、10mmol/ml LiCl组和10ug/L KGF组干预后3d、5d、7d、9d细胞的β-catenin、APC、GSK-3β、Axin和LEF1的mRNA水平,观察转录水平情况,探讨LiCl和KGF诱导HFSCs分化过程中,不同时间点的Wnt/β-catenin信号途径及其相关信号因子的表达和相互作用。3.PLGA纳米微球在组织工程皮肤构建的实验研究:制备PLGA纳米微球,以扩增培养HFSCs为种子细胞,以载荷LiCl-PLGA及KGF-PLGA的脱细胞真皮(ADM)为支架材料,体外形成组织工程细胞皮片。对该膜片进行细胞活性染色及扫描电镜观察,评价该组织工程皮片,为动物实验奠定良好基础。结果:1.从人头皮成功分离培养出HFSCs,在体外经多次传代后仍具有很强的增殖能力和多向分化潜能,当HFSCs接种密度为1×10~5ml时,细胞增殖速度最快,扩展能力强;2.随LiCl浓度升高,细胞增殖效应减弱,而KGF随浓度增高增殖能力增强。含有LiCl的K-SFM条件培养基中HFSCs形态改变明显,各组间有明显差别,LiCl>10mmol/L时分化比例高;而含有KGF的K-SFM条件培养基中HFSCs向表皮细胞分化,β-catenin变化不明显。实验发现,LiCl在促HFSCs分化中,激活Wnt/β-catenin信号通路,抑制降解复合物重要成分GSK-3β的表达下降,促使β-catenin在细胞浆表达增加并转入核内,增加靶基因转录,表明LiCl促HFSCs分化的效应与Wnt/β-catenin信号通路激活有关。3.扫描电镜观察细胞在PLGA-ADM材料上生长良好,分泌的胞外基质丰富,并随时间进展,细胞逐渐融合,细胞外基质分泌逐渐增多。DIO染色观察HFSCs均匀分布于真皮替代物中。细胞生长曲线测定表明细胞在材料上生长良好。细胞活性染色检测到构建皮肤上还有克隆团生长。结论:1.人HFSCs在体外有较强的增殖及传代能力,1×10~5/ml接种密度是促进HFSCs增殖的最佳密度;2.LiCl可促HFSCs分化明显,促增殖效应弱于K-SFM条件培养基,当LiCl>10 mmol/L浓度是促HFSCs分化的最佳浓度,但增殖效应减弱;KGF可促进HFSCs向表皮分化,是促进HFSCs增殖和迁移,促进创面再上皮化,促进创面愈合的重要因素。LiCl和KGF促HFSCs分化作用可能与激活Wnt/β-catenin信号通路,促使β-catenin表达改变,激活了Wnt信号的相关靶基因的转录。3. PLGA材料具有良好的细胞相容性,人HFSCs能在其上较好的粘附和生长。构建人HFSCs的LiCl-PLGA复合物,能够使构建皮肤的种子细胞定向分化,使构建带有皮肤附属器的组织工程替代物成为可能;构建人HFSCs的KGF-PLGA复合物,能够加快膜片表面细胞生长。