研究背景：生物膜(biofilm)是阿萨希毛孢子菌感染宿主的重要毒力因素之一,其致病性及耐药机制日益受到人们的关注。既往体外研究发现,生物膜状态下真菌对抗真菌药物伏立康唑的最低抑菌浓度(SMTC)是游离状态下(MIC)的16,00倍左右,其耐药性显著提高,可导致生物膜相关真菌感染治疗的失败；因此寻找一种新的、有效治疗策略是十分紧迫的。乙醇是一种应用广泛的临床消毒剂,既往对于其他病原微生物的研究发现,乙醇具有良好的抑制生物膜形成或清除已形成生物膜的作用；但目前尚无关于乙醇对阿萨希生物膜影响的研究。生物膜相关感染一般比较难以治疗,由于其对常规抗真菌药的高耐药性,导致治疗失败及患者较高的死亡率。以往的研究显示,乙醇可以有效抑制白念珠菌及金黄色葡萄球菌生物膜的形成,鉴于白念珠菌与阿萨希毛孢子菌均为酵母菌,且在结构和耐药性上有诸多相似之处；因此,我们推测,乙醇对阿萨希毛孢子菌生物膜可能具有抑制作用。乙醇是一种广泛用于临床医学的消毒剂,其优势在于价廉,易于获得且无明显毒副作用。课题以本实验室现存阿萨希毛孢子菌作为研究对象,研究乙醇对其生物膜形成各阶段的作用。研究目的：1.构建阿萨希生物膜体外模型；2.观察阿萨希毛孢子菌及其生物膜对乙醇的敏感性；3.观察不同浓度乙醇对阿萨希毛孢子菌生物膜形成不同阶段的作用。研究方法：1.构建阿萨希生物膜体外模型。使用96孔板法构建阿萨希毛孢子菌生物膜。用PMRI-1640将对数生长期阿萨希毛孢子菌调成106的标准菌悬液,加入96孔板的不同孔中,37℃孵育1h后,PBS缓冲液冲洗2次,并更换PMRI-1640,37。C继续孵育至48h,其中每24h更换一次PBS缓冲液,从而成功构建阿萨希毛孢子菌生物膜。2.检测阿萨希毛孢子菌游离细胞及生物膜对乙醇的敏感性。根据美国CLSI的M27-A3微量稀释法对阿萨希毛孢子菌其游离细胞进行药敏实验,基于96孔板的真菌生物膜药敏检测法测定其生物膜细胞对乙醇敏感性,并用XTT法测定乙醇作用后,阿萨希毛孢子菌生物膜的代谢活性。3.观察不同浓度乙醇对阿萨希毛孢子菌生物膜形成不同阶段的作用。用PMRI-1640将乙醇调配成各种不同浓度,分别加入形成于96孔板中不同形成阶段的阿萨希毛孢子菌生物膜中(包括：阿萨希毛孢子菌生物膜粘附阶段(0.5h,1h,1.5h),阿萨希毛孢子菌生物膜形成阶段(2h,4h,8h,12h),阿萨希毛孢子菌生物膜成熟阶段(48h),通过倒置显微镜观察和XTT法检测乙醇对其的影响。研究结果：1.构建阿萨希毛孢子菌生物膜体外模型。来源于北京军区总院皮肤损伤与修复研究所中心实验室的T.asahii CBS2479(临床来源)、T. asahii CBS8904(环境来源)、临床分离株(菌株号：BZP07003,BZP07004, BZP09001, BZP09002)以及北京大学第一医院真菌研究中心惠赠的临床分离株(菌株号：06108,06198,6674,6956)均可形成生物膜,且其体外模型均已成功构建。2.乙醇对阿萨希毛孢子菌游离细胞及生物膜的敏感性。经XTT比色法检测发现,不同株阿萨希毛孢子菌生物膜的最低抑菌浓度(MIC)值各不相同,游离细胞MIC值为4-12.5g/m1,MIC50为8g/ml,MIC80为12.5g/ml；生物膜MIC值为25-50g/ml,SMIC50为25%,SMIC80为50%。2.观察不同浓度乙醇对阿萨希毛孢子菌生物膜形成不同阶段的作用。1)生物膜粘附阶段(0.5h,1h,1.5h)：本研究发现2%乙醇作用1小时可以明显抑制阿萨希毛孢子菌细胞的粘附,有效降低粘附率2)菌相转换：4%乙醇作用8小时可以明显抑制阿萨希毛孢子菌的出芽率,低浓度乙醇(0.125%,0.25%,1%)则可以促进阿萨希毛孢子菌的出芽。3)生物膜早期形成阶段(2h,4h,8h,12h)：25%乙醇作用8小时可明显抑制阿萨希毛孢子菌生物膜的早期形成过程。4)成熟生物膜阶段(48h)：25%乙醇作用24h可明显去除阿萨希毛孢子菌成熟生物膜生长,50%乙醇作用24h可有效去除已形成的阿萨希毛孢子菌成熟生物膜。结论：1.阿萨希毛孢子菌有形成生物膜的能力,并且利用96孔板法,可在体外构建阿萨希毛孢子菌生物膜模型。2.不同浓度的乙醇可有效抑制阿萨希毛孢子菌生物膜形成的不同阶段。3.乙醇可有效抑制阿萨希毛孢子菌游离细胞及生物膜,并且未出现耐受性。4.为阿萨希相关生物膜感染提供了一种新的治疗策略,并对真菌生物膜相关感染的治疗提供了新的思路和实验依据。