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为进一步了解短小芽孢杆菌BSH-4菌株的拮抗作用机制,以黄瓜菌核病菌Sclerotinia sclerotiorum为指示菌测定了该菌株抗菌蛋白的抗菌活性,优化了发酵条件,对抗菌蛋白进行了抗菌谱测定、理化性质分析,初步研究了抗菌蛋白的分离条件,从而为进一步生防应用打下基础。1.为明确BSH-4菌株及其抗菌蛋白的抑菌谱,采用平板对峙法和平板打孔法分别测得此菌株及其抗菌蛋白的抗菌活性。结果表明,此菌株及其抗菌蛋白对黄瓜菌核病菌、黄瓜猝倒病菌、黄瓜蔓枯病菌、黄瓜枯萎病菌、黄瓜立枯病菌、番茄早疫病菌、辣椒疫病病菌、茄子绵疫病菌等8种常见蔬菜病原真菌均具有抑菌活性。且经多次转接后,此菌株的抑菌活性基本不变。2.为提高短小芽孢杆菌BSH-4产生抗菌蛋白的能力,采用单因素和正交试验设计法对BSH-4发酵培养基的组成及其发酵条件进行了优化。结果表明,此菌株的最佳发酵培养基组成为:玉米淀粉2 %,酵母浸膏2 %,CaCl2 0.4 %;最佳发酵条件为:发酵时间48 h,摇瓶转速180 r/min,培养温度37℃,初始pH值6.0,接种量6 %,装液量25 mL(50 mL三角瓶)。在此优化条件下,BSH-4经发酵产生的抗菌蛋白的浓度为16.8μg/mL。3.为明确短小芽孢杆菌BSH-4抗菌蛋白的理化性质,研究了温度、pH值、紫外照射、有机溶剂、金属离子及蛋白酶对其稳定性的影响,并以不同培养基为底物对该蛋白的功能进行初步判断。结果表明,该抗菌蛋白粗提液具有良好的热稳定性,100℃处理1 h后仍具有对照活性的90%左右;对酸碱较敏感,在pH值6-9时活性较高;对紫外线稳定,在紫外光下照射10 h以上时,其活性基本不受影响;对乙醚、丙酮、乙酸乙酯和氯仿不敏感,其活性基本不变,而对甲醇较敏感,其活性下降20%以上;对重金属离子敏感,浓度为10mmol/L的Ag+、Cu2+、Zn2+能够降低活性的40%左右;对蛋白酶较稳定。底物特异性试验表明该蛋白不是几丁质酶、羧甲基纤维素酶和β-1,3-葡聚糖酶。4.初步研究了短小芽孢杆菌BSH-4抗菌蛋白对核盘菌的抑菌机制,采用菌丝生长速率法测定了其对黄瓜菌核病菌Sclerotinia sclerotiorum菌丝生长的毒力,及其对菌丝形态、菌核形成、菌核萌发和菌体细胞膜透性的影响。结果表明,此抗菌蛋白粗提物对核盘菌菌丝生长的EC50值为10.13μg/mL,明显低于对照药剂乙霉威及腐霉利;经此抗菌蛋白处理后,菌丝形态出现黄化、畸形等现象,但尚未发现细胞质外渗;菌核形成的时间有所延长,数量有所减少,且重量略有降低;在此抗菌蛋白粗提物浓度为250μg/mL时不能完全抑制菌核萌发;对菌体细胞膜渗透势的影响不大。5.BSH-4菌株抗菌粗蛋白经Sephadex G-100分子筛柱层析后得两个活性洗脱峰,取活性高的组分进行浓缩,SDS-PAGE电泳检测蛋白纯度得两条电泳图带,分别将条带切下,缓冲液提取后平板打孔法检测,其中一条小分子带有抑菌活性。