胶质瘤是中楸神经系统最常见的原发性肿瘤，WHOIII，IV级胶质瘤(间变性星形细胞瘤以及胶质母细胞瘤)具有高度侵袭性，术后复发快，并对放疗和化疗表现出内在抗性，患者预后不佳。尽管如此针对恶性胶质瘤的传统治疗包括扩大性根治切除并辅助放疗及化疗等多种方式，患者一年期累积生存率仍小于30％，仅有3％的患者生存期超过5年，总平均生存时间6-9个月。多年来，针对胶质母细胞瘤的治疗方式不断改进，但却未能改进该病的总体预后，因此寻找和发现治疗恶性胶质瘤更加有效的新方法已成为神经肿瘤学研究领域的重大挑战。阐明恶性胶质瘤的致病分子通路及其对抗放化疗的分子基础，是寻找和确认有效的治疗靶点、发展合理的新综合治疗策略的关键。　　 基因表达芯片是今年来新兴的一项研究肿瘤发生发展过程的技术。利用基因表达芯片技术，通过比对恶性胶质瘤患者的肿瘤样品总mRNA以及非肿瘤患者的脑组织样本总mRNA，我们希望筛选出恶性胶质瘤患者特异性表达的癌基因标志物，并研究其导致恶性胶质瘤发生发展的分子机制，希望发现将来治疗的新靶点。通过基因芯片，我们筛选出一系列在恶性胶质瘤中特异性高表达的癌基因，包括AEG-1(Astrocyte Elevate Gene-1)，SPHK1( Sphingosine Kinase-1)，FoxM1(Forkhead Transcription Factor M1)，VEGF(vascular endothelialgrowth factor)等。在大样本的乳腺癌标本以及恶性胶质瘤标本的研究中发现，AEG-1,SPHK1,FoxM1等癌基因表达水平和肿瘤分级，患者生存期呈高度负相关，可作为新的检测肿瘤发生的早期标志物以及作为肿瘤患者预后判定的标志物。同时，我们深入研究了FoxM1通过调控VEGF基因导致恶性胶质瘤发生中的具体分子机制。　　 新生血管和缺氧性酸中毒是包括恶性胶质瘤在内的实体性肿瘤形成的标志性指标。vascular endothelialgrowth factor(VEGF)是最重要的导致新生血管形成的生长因子之一。作为血管通透性和新生血管早期诱导因子，VEGF在恶性胶质瘤中表达极高并对恶性胶质瘤的快速生长和浸润起到重要的作用。目前认为，缺氧和酸中毒均为诱导VEGF的表达的重要因素，包括通过HIF-1(hypoxia inducefactor-1)等导致的VEGF高表达；同时VEGF表达也受到多种转录调控因子的调节，例如STAT3(signal transducer and activator of transcription3)等。研究表明，HIF-1在肿瘤内部缺氧的环境下表达增高，并直接作用于VEGF基因的启动子，诱导VEGF基因mRNA表达。然而，在恶性胶质瘤中，VEGF增高也常见于肿瘤浸润正常组织的边缘，而这些边缘部位并无十分明显的缺氧环境。与此同时，在某些含氧量趋于正常的恶性胶质瘤细胞系中也可以检测到过量表达的VEGF。此外，STAT3诱导VEGF表达也颇具争议，目前的公认意见倾向于STAT3对VEGF的作用决定于肿瘤本身的遗传背景。例如报道指出，在某些恶性胶质瘤细胞系中，STAT3的表达可以促进体外肿瘤的存活，而其他的报道则指出在STAT3另一些恶性胶质瘤中则基本无表达。在VEGF对恶性胶质瘤的作用十分明确的前提下，研究其他导致恶性胶质瘤中VEGF增高的原因显得十分必要。　　 FoxM1(Forkhead Transcription Factor M1)属于Fork Head(Fox)转录因子家族，在细胞周期G2/M期调控有重要作用。FoxM1在细胞进入G2期时表达量急剧增加，在细胞进入M期后立即降解，对保持细胞分裂过程的顺利进行起着精确的调控作用。FoxM1的异常表达可以导致细胞分裂加速.生长失去控制而引起肿瘤发生。前期报道显示，在多种实体性恶性肿瘤，包括乳腺癌，肝癌，前列腺癌，肺癌和大肠癌等中FoxM1均有不同程度的高表达。最近，两则独立研究报道显示FoxM1在恶性胶质瘤中也有明显的增加。Dr.Huang实验室的研究表明，FoxM1是胶质瘤中主要表达的FoxM1蛋白，并且FoxM1在正常脑组织中未见表达。此外，FoxM1的表达和恶性胶质瘤的分级高度正相关，并且和患者的生存期高度负相关。在动物模型中，增加FoxM1的表达导致胶质瘤细胞的致瘤性和侵袭性增加。在间变性星形细胞瘤细胞中过表达FoxM1,可以在试验动物体内形成高度恶性并伴高度新生血管生成的胶质母细胞瘤。这提示我们FoxM1对肿瘤的血管生成起着重要的作用。　　 本课题研究中，我们提取了60例恶性胶质瘤患者的手术肿瘤标本总mRNA以及20例非肿瘤患者的手术标本总mRNA，利用基因表达芯片技术，我们分析了肿瘤患者和非肿瘤患者间的mRNA表达差异，筛选出一系列的在恶性胶质瘤中高特异性高表达的癌基因。在这些癌基因中，我们选择了AEG-1,SPHK1以及FoxM1进行研究。通过大样本的乳腺癌标本(225例)的免疫组化染色证明，AEG-1在肿瘤中高表达，并且和肿瘤的分级以及患者预后高度负相关。在大样本的胶质瘤标本(243例)中的免疫组化染色证实，SPHK1也和肿瘤分级以及预后高度负相关。接下来，我们在胶质瘤细胞系和乳腺癌细胞系中的研究发现，AEG-1和SPHK1在蛋白水平和mRNA水平与正常细胞相比呈高表达，并且在患者样本中证实了以上结果。通过我们的研究表明，AEG-1和SPHK1均可以作为肿瘤发生的早期诊断指标，并可以作为预期的治疗靶点。　　 FoxM1作为另外一个筛选出的癌基因，已有研究表明其在恶性胶质瘤中高表达，并与患者预后以及生存期高度负相关。为了研究FoxM1和VEGF在导致恶性胶质瘤发生的具体机制，我们阐明FoxM1以及VEGF在人脑胶质瘤中的表达状况，从而了解FoxM1,VEGF与胶质瘤临床病理特征的相关性；继而阐明FoxM1调节VEGF的具体分子机制，最后在动物模型中验证FoxM1调节VEGF导致肿瘤形成。我们首先比较FoM1和VEGF在低级别胶质瘤，间变性星形细胞瘤和胶质母细胞瘤患者标本中的表达，FoxM1表达和VEGF表达呈高度正相关。利用免疫组化检测胶质母细胞瘤石蜡包埋切片59例，我们发现VEGF表达不仅局限于肿瘤中心缺氧部位，并且在肿瘤浸润边缘也十分明显。然而，在扩大切除标本中相对“正常”的脑组织中并无VEGF表达。统计表明，FoxM1表达和VEGF表达程度高度相关(r=0.79，p<0.001)。类似的相关性结果也在间变性星形细胞瘤中观察到(r=0.75，p<0.001)。同时在冰冻切片中通过共聚焦显微镜观察发现，细胞核内FoxM1表达高的细胞，包浆以及周围表达VEGF含量也相应增高。不同级别的胶质瘤标本蛋白水平显示，FoxM1表达水平和VEGF表达水平高度相关。为了阐明FoxM1调节VEGF的分子机制，我们建立了FoxM1稳定过表达的两株间变性星形细胞瘤细胞株SW1783-FoxM1以及HS683-FoxM1,同时建立了两株FoxM1稳定沉默的胶质母细胞瘤细胞株U87-FoxM1shRNA以及U251-FoxM1shRNA，在体外试验发现，稳定表达FoxM1可以在SW1783和HS683细胞水平增加VEGFmRNA和蛋白水平的表达，而通过RNAi沉默FoxM1则降低了U87和U251细胞株中VEGFmRNA和蛋白水平的表达。为了研究FoxM1调控VEGF表达的机制，我们克隆了VEGF的启动子，通过双荧光素酶报告系统证明了FoxM1可以直接激活VEGF的启动子。进而，我们通过点突变技术改变了VEGF启动子上FoxM1结合的关键位点的序列，发现FoxM1无法激活突变的VEGF启动子。从而证明了FoxM1的结合位点对于VEGF的激活具有关键性的作用。同时我们运用了CHIP技术，在细胞内证实了FoxM1结合到VEGF启动子区域的特异性结合位点。为了证明FoxM1和VEGF启动子的直接结合，我们采用EMSA技术，使用磷32放射性标记证明FoxM1在体外可以和VEGF启动子上特异性的FoxM1识别位点完全结合。Super Shfit试验表明，FoxM1和VEGF启动子的结合具有特异性。最后，为了在体内试验证明FoxM1调节VEGF表达，我们在裸鼠试验中采用原位注射的方式，直接诱导裸鼠产生胶质瘤。在动物模型试验中我们发现，U251和U87细胞原位注射诱导裸鼠产生胶质瘤的成功率为100％，(5/5，5/5)而稳定沉默FoxM1的改建细胞则几乎无法诱导胶质瘤的形成(0/5，1/5)。肿瘤切片染色显示，VEGF以及新生血管标志物vWF表达在FoxM1沉默后均有降低，从而证实了我们最初提出的假设。我们的研究结果为FoxM1通过调控VEGF从而促进胶质瘤的形成和生长提供了第一手证据，显示FoxM1是在胶质瘤形成和发展的重要因素，进一步提示了将FoxM1作为恶性胶质瘤治疗靶点的可能性。