糖基磷脂酰肌醇(Glycosylphosphatidylinositol,GPI)对蛋白的锚定是一种在内质网中广泛存在于真核细胞中的高度保守的蛋白质翻译后修饰方式。目前,在哺乳动物细胞中已发现约150余种蛋白质通过GPI锚定于细胞表面,包括补体调节蛋白、细胞粘附分子、肿瘤标志物等,它们参与了重要的生命过程,如细胞识别、生长、分化和程序性死亡等。在GPI的生物合成途径中,一个酰基链被转运到GPI中间体的肌醇的2号位。在蛋白质与GPI锚结合后,此酰基键就被GPI肌醇脱酰酶PGAP1切除。近两年,不断有临床数据发现因PGAP1缺陷引起的智力残疾、脑病、肌张力过低症等常见疾病表型。但是,在内质网中哪些因子参与GPI肌醇脱酰化以及肌醇脱酰基化是如何被调控的,至今相关研究尚未取得突破性的进展。利用糖基磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(phosphatidylinositol(PI)-specific phospholipase C,PI-PLC)可以剪切正常状态下的GPI锚,但是无法剪切酰基化的肌醇这一特性来检测GPI锚定蛋白的酰化状态。在PGAP1缺陷型细胞中,经PI-PLC处理后,GPI锚定蛋白CD59呈现阳性,表明几乎所有GPI的肌醇都维持酰基化状态,因此表现出了PI-PLC抗性。利用其对PI-PLC的敏感性差异,进行全基因组筛选来探究与GPI肌醇脱酰化相关的基因。将基因诱捕载体与人类单倍体HAP1细胞株的基因组整合在一起,对其基因组进行随机突变。通过筛选来富集对PI-PLC有抗性的突变细胞。利用新一代测序技术对富集的阳性细胞群和未选择的阴性细胞群分别进行测序从而确定基因诱捕插入位点。通过测序比对,除了PGAP1外,我们还发现了7个候选基因,其中包括参与蛋白折叠的编码基因,说明此筛选方法具有可行性和高效性。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术在HEK293FF6细胞株中分别敲除这些候选基因,发现这些单克隆基因敲除细胞株中的GPI锚定蛋白对PI-PLC有部分抗性。分别在这些单克隆突变株中过表达hPGAP1后,PI-PLC抗性都得到了回补,说明这些基因都直接或间接地参与到GPI肌醇脱酰化的调控机制中。钙联蛋白CANX的凝集素活性是GPI锚定蛋白对PI-PLC产生抗性的必要条件。此外,α-葡萄糖苷酶的活性的降低会引起PGAP1的功能缺陷。以Cas9介导的MOGS-KO单克隆突变株为基础,进一步敲除了ALG6和ALG8基因,在双基因突变细胞群中,GPI锚定蛋白CD59对PI-PLC的敏感性得到了一定的回补。由此,提出了N-聚糖依赖途径的假说,初步建立模型来解释此途径中相关基因在GPI肌醇脱酰化中发挥的作用。本研究中,对筛选得到的内质网中GPI肌醇脱酰化相关基因与GPI肌醇脱酰酶PGAP1的关系进行了初步讨论。