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第一部分大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养及鉴定目的:成功分离、培养大鼠骨髓间充质干细胞,为后继研究提供种子细胞方法:采用全骨髓贴壁法体外分离、培养、纯化大鼠骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs),进行形态学观察,绘制生长曲线,采用流式细胞技术检测细胞表面标记物,并行成骨、成脂能力鉴定结果:全骨髓贴壁法获取的大鼠BMSCs经1~2次传代后,细胞呈放射状或螺旋状排列生长,形态趋于一致,细胞生长稳定。细胞表面CD29,CD44,CD90阳性表达,CD11B,CD45阴性表达,一定条件诱导下,油红O染色、碱性磷酸酶染色阳性。结论:实验所获得的BMSCs具有间充质干细胞的一般生物学特性,经诱导培养后具有多向分化潜能,成功获取了BMSCs第二部分重组腺病毒BMP-9扩增转染BMSCs目的:获取高滴度的重组腺病毒BMP-9,并转染BMSCs,监测其转染后BMP-9的表达水平。方法:利用HEK293细胞扩增获取高滴度的重组腺病毒BMP-9,不同滴度转染大鼠BMSCs,荧光显微镜下观察BMP-9的转染率,绘制转染后BMSCs的生长曲线,采用Western blot技术检测转染后不同时间BMP-9蛋白在BMSCs中的表达结果:采用2ul病毒转染扩增,收集病毒感染液滴度为1×108pfu/ml。当MOI值为100时,Ad-BMP-9腺病毒转染大鼠BMSCs的转染效率为80%~90%,MTT法测定细胞生长曲线,细胞的增殖不受转染影响,与未转染组比较无明显差异。转染后在3d时即可检测到BMP-9蛋白水平表达,在1W时最高,之后逐渐减弱,4w时仍可监测到BMP-9蛋白表达。结论:当MOI值为100时,Ad-BMP-9腺病毒转染BMSCs,BMP-9稳定表达,细胞的增殖不受转染影响,符合实验要求。第三部分BMP-9联合二磷酸盐对成骨分化影响目的:不同浓度阿伦磷酸钠刺激转染有BMP-9基因BMSCs,在体外观察对其成骨作用的影响方法:采用10-5、10-6、10-7、10-8、10-9Mol/L浓度Aln刺激大鼠BMSCs,作用后5d、10d时行碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase ALP)染色及定量监测;以10-7、10-8、10-9Mol/L浓度的阿仑膦酸钠(Alendronate Aln)刺激转染BMP-9基因的BMSCs,于5d、10d行ALP染色及定量监测;最后将实验分为10-7Aln+BMP-9,10-9Aln+BMP-9,BMP-9,10-7Aln,10-9Aln,GFP,control组,分别于7d、14d行茜素红、抗酒石酸酸性磷酸酶染色、荧光定量PCR、Western blot测定OCN、OPN、Rankl表达情况结果:不同浓度Aln作用于BMSCs后,随Aln浓度的增加,ALP活性升高,在10-7Mol/L时达到最高,此后逐渐下降。其中相应浓度的Aln,10d时的活性弱于5d时的活性。用10-7~10-9Mol/L浓度Aln与BMP-9共同作用于BMSCs以后,ALP活性有更大的提高,随Aln浓度的增加,这种协同作用进一步增强,但之间统计学差异不明显(P>0.01)。茜素红染色结果显示BMP-9组明显增加了钙盐沉积,相比BMP-9组,不同浓度Aln与BMP-9联合应用,钙盐沉积显著增加,随Aln浓度增加而增强,但不同浓度间统计学差异不明显(P>0.01)。抗酒石酸酸性磷酸酶(Tartrate resistant acid phosphatase TRAP)染色显示:BMP-9能诱导表达TRAP染色阳性的细胞,并且14d时染色强度要强于7d,而Control组、GFP组、Aln组均未见TRAP染色阳性细胞出现,当加入Aln时,TRAP染色阳性细胞的量明显减少。Western blot及Real-time RT-PCR结果显示:在7d、14d时,BMP-9联合使用Aln后,OPN、OCN表达较单独使用Aln、BMP-9升高显著(P<0.01),并且随Aln浓度的增加,这种协同作用有所提高,但10-7Aln+BMP-9,10-9Aln+BMP-9但之间统计学差异不显著(P>0.01);Aln能明显抑制RANKL的表达(P<0.01),但两种Aln剂量间抑制效果差异不明显(P>0.01),而单独使用BMP-9却增加了RANKL的表达(P<0.01),当加入Aln后,这种效果被抑制,与BMP-9组相比,10-7Aln+BMP-9,10-9Aln+BMP-9组RANKL表达显著降低(P<0.01),但两种剂量间差异不显著(P>0.01)结论:BMP-9在骨形成早期、晚期均能促进BMSCs向成骨细胞分化,但同时也诱导了与破骨细胞形成相关因子的表达,Aln能抑制BMP-9对破骨细胞调节的正面作用,抑制BMP-9诱导BMSCs向破骨样细胞分化,并且两者在成骨诱导方面具有交互作用,这在细胞层面为BMP-9与Aln联合治疗提供了依据。第四部分BMP-9联合二磷酸盐对内植物-骨界面作用的体内研究目的:在体内研究BMP-9联合二磷酸盐对内植物在骨内固定作用的影响方法:64只6月龄SD大鼠随机分成4组,每组16只:单纯螺钉固定组(Control组)、阿伦磷酸钠组(Aln组)、BMP-9转染组(BMP-9组)、BMP-9转染+阿伦磷酸钠组(BMP-9+Aln组)。双侧卵巢切除后3月,分别于双侧胫骨近心端植入螺钉,BMP-9组和BMP-9+Aln组同时植入转染有BMP-9的BMSCs,在螺钉植入后即刻,Aln组和BMP-9+Aln组分别以1ml/kg皮下注射Aln,每周2次;其余组分别皮下注射等量生理盐水。在螺钉植入后4w、8w每组各处死8只大鼠,进行生物力学测定、Micro-CT扫描、硬组织切片V-G染色、脱钙骨BMP-9免疫组化染色。结果:4w、8w时BMP-9+Aln组螺钉拔出力比Control组升高1左右,比BMP-9组和Aln组也有显著提高(P<0.01),Micro-CT结果显示BMP-9+Aln组BV/TV、TB.TH、Tb.N升高分别是Control组的5倍、1倍、1倍左右,但Tb.Sp不到Control组的一半(P<0.01),Aln组和BMP-9组BV/TV、TB.TH、Tb.N也明显增加,但效果较BMP-9+Aln组差,Tb.Sp降低也差于BMP-9+Aln组。硬组织切片V-G染色显示4w时,BMP-9+Aln组螺钉螺纹间可见大量骨组织长入,周围也有较多骨质形成,其螺钉与骨的接触率比Control组多近2倍(P<0.01),Aln组和BMP-9组螺纹间也有部分骨质长入,BMP-9显著多于Aln组(P<0.01),但螺钉周围骨组织量要少于Aln组;8w时,与Control组相比,各组间均有较多骨组织形成,螺纹间骨质长入增多,以BMP-9+Aln组最明显,其螺钉与骨的接触率比Control组多近1倍(P<0.01),BMP-9螺纹间骨长入增多,骨接触率明显高于Aln组,但周围骨组织少于Aln组。BMP-9免疫组化染色显示4w时BMP-9组和BMP-9+Aln组可见成骨细胞和成熟的骨细胞胞浆内BMP-9阳性表达,8w时表达减弱,而Control组和Aln组一直未见BMP-9明显阳性表达。结论:转染有BMP-9基因的BMSCs细胞植入体内后,可在骨形成过程中持续表达BMP-9。Aln能显著提高螺钉周围的骨量,提高螺钉的抗拔出能力,相对于Aln,BMP-9改善螺钉固定主要是通过提高螺纹间的骨长入,提高骨与螺钉的接触率,当BMP-9联合Aln治疗时能显著提高内植物在骨内的稳定,在增加内植物周围骨组织量,增加与骨的接触方面具有交互作用。