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结直肠癌是消化道常见的恶性肿瘤,其中Ⅰ期、Ⅱ期的患者5年生存率为90%和82%,Ⅳ期伴远端转移的患者生存率仅12%,由于早期结直肠癌的症状不明显,部分新发患者已进展至中晚期,现有的治疗预后欠佳,且伴随不良反应,目前大量研究表明中药可辅助抑制患者肿瘤细胞的增殖、延长患者生存期等,因此开发有抗结直肠癌活性的中药新药有重大意义。结直肠癌的发生机制相对复杂,约85%左右的结直肠癌的发展遵循腺瘤-癌序列,目前大量的临床报道Hedgehog信号通路参与结直肠癌的发生发展,且在腺瘤-癌途径中发挥一定的作用,近年来研究发现Hedgehog信号通路参与多种肿瘤细胞的增殖凋亡、细胞周期、侵袭迁移等活动,因此此通路可作为结直肠癌防治的切入点深入研究。中医理论中结直肠癌的关键病理产物为痰瘀,治以化痰散结软坚祛瘀,贝母有化痰散结之功,富含多种化学成分,其活性成分主要为生物碱和皂苷类,目前研究发现贝母中生物碱具有良好的抗肿瘤的功效,其中活性作用最强的贝母辛已被证实可抑制结肠癌细胞的活性,其与Hedgehog信号通路的关键通路蛋白进行分子对接预测发现贝母辛与通路关键蛋白结合均具备理想的活性效果,但具体的抗结肠癌的作用机制尚不明确,值得进一步研究。本研究首先探讨贝母辛体外抗结肠癌细胞的作用和对Hedgehog信号通路的调控,以此为基础,运用Hedgehog信号通路的激动剂验证贝母辛对通路及其下游目标蛋白的调控,在体外研究的基础上构建结肠癌皮下荷瘤小鼠模型,探索贝母辛体内抗结肠癌的作用及机制。研究一 贝母辛体外抗结肠癌的作用探究目的:探讨贝母辛对结肠癌细胞活力、增殖、凋亡和侵袭转移能力的影响。方法:（1）MTT法检测贝母辛对三种人结肠癌细胞HT29、HCT116、SW480活力的影响,贝母辛作用于细胞HT29、HCT116、SW480的浓度梯度设置为（0μM、2.5μM、5μM、10μM、20μM、40μM、80μM、160μM、320μM）,根据结果调整贝母辛对SW480细胞的作用浓度范围,浓度梯度设置为（100μM、120μM、140μM、160μM、320μM、640μM、1280μM、2560μM）,作用 24h。根据结果筛选 HCT116为后面实验细胞,MTT法检测贝母辛作用HCT116 12h、24h、48h、72h后的细胞活力。（2）平板克隆实验检测贝母辛对HCT116细胞增殖的影响,根据浓度梯度分为四组:空白对照组（Control）、贝母辛10μM（Peimisine 10μM）组、贝母辛20μM（Peimisine20μM）组、贝母辛 40μM（Peimisine40μM）组,观察每组形成的细胞克隆数。（3）TUNEL免疫荧光染色法和流式细胞仪检测贝母辛对HCT116细胞凋亡的影响,分析 Control、Peimisine 10μM、Peimisine 20μM、Peimisine 40μM 组细胞的凋亡率。（4）流式细胞仪检测贝母辛对HCT116细胞周期的影响,分析Control、Peimisine 10μM、Peimisine 20μM、Peimisine 40μM 组各周期的细胞比例。（5）Transwell小室实验和划痕实验检测贝母辛对HCT116细胞侵袭和迁移的影响,分析 Control、Peimisine 10μM、Peimisine 20μM、Peimisine 40μM 组细胞的穿膜数量和迁移距离。（6）用 Western blot 技术检测 Control、Peimisine 10μM、Peimisine 20μM、Peimisine 40μM 组 CyclinD1、Bc12、Caspase3 蛋白的表达。结果:（1）MTT实验结果显示贝母辛对HCT116、HT29、SW480三种人源结肠癌细胞均有抑制作用,其中对HCT116细胞的抑制最佳,且最佳作用时间为24h。（2）平板克隆实验结果显示,与Control组相比,Peimisine 10μM组（P＜0.01）、Peimisine20μM 组（P＜0.001）、Peimisine40μM（P＜0.0001）组形成细胞克隆数均减少。（3）TUNEL免疫荧光染色法结果显示,与Control组相比,Peimisine20μM组、Peimisine40μM组凋亡细胞比例均增多（P＜0.0001）;流式细胞仪检测细胞凋亡结果显示,与Control组相比,Peimisine 20μM组、Peimisine 40μM组凋亡细胞比例均增多（P＜0.01）。（4）流式细胞仪检测细胞周期结果显示,Control组S期细胞比例为 15.77%,Peimisine10μM 组、Peimisine20μM 组、Peimisine40μM组的S期细胞比例分别为17.95%、20.39%、23.08%,药物组S期细胞比例增多。（5）划痕实验结果显示,与Control组相比,Peimisine20μM组、Peimisine40μM组细胞的迁移距离均减小（P＜0.01）;Transwell实验结果显示,与Control组相比,Peimisine 10μM 组（P＜0.05）、Peimisine 20μM 组（P＜0.001）、Peimisine40μM 组（P＜0.001）穿膜细胞数均减少。（6）WB结果显示与Control组相比,Peimisine 10μM组（P＜0.05）、Peimisine20μM 组（P＜0.05）、Peimisine 40μM（P＜0.01）组的CyclinD1 蛋白均被下调,Peimisine 10μM 组（P＜0.01）、Peimisine 20μM组（P＜0.01）、Peimisine 40μM 组（P＜0.001）的 BCL-2 蛋白均被明显下调,Peimisine 40μM 组的 Caspase3 蛋白被上调（P＜0.05）。结论一:贝母辛可以抑制HCT116细胞的增殖和侵袭迁移,并诱导细胞凋亡;贝母辛可能通过下调CyclinD1蛋白引起S期细胞阻滞进而抑制细胞增殖,并下调Bcl2蛋白上调Caspase3蛋白诱导细胞凋亡。研究二 贝母辛基于Hedgehog信号通路体外抗结肠癌的机制探究目的:基于Hedgehog信号通路探讨贝母辛对HCT116细胞增殖、凋亡的调控机制。方法:（1）Western blot 技术检测 Control、Peimisine 10μM、Peimisine 20μM、Peimisine40μM 组PTCH1、SMO、GLI1 蛋白的表达情况;Western blot 技术检测对照组（Control组）、贝母辛40μM组（Pei组）、贝母辛40μM+Purmorphamine1.5μM 组（Pei+Pur 组）PTCH1、SMO、GLI1、CyclinD1、Bc12、Caspase 3蛋白的表达情况。（2）平板克隆实验、TUNEL免疫荧光染色法、流式细胞仪检测Control组、Pei组、Pei+Pur组细胞的增殖、凋亡情况。结果:（1）WB 结果显示,与 Control 组相比,Peimisine 10μM 组（P＜0.0001）、Peimisine 20μM 组（P＜0.0001）、Peimisine 40μM（P＜0.0001）组的 SMO 蛋白均下调,Peimisine 40μM 组的 GLI1 和 PTCH1 蛋白下调（P＜0.05）;与 Pei 组相比,Control组PTCH1（P＜0.01）、SMO（P＜0.0001）、GLI1（P＜0.05）蛋白均上调,Pei+Pur组PTCH1(（P＜0.05）、SMO（P＜0.01）、GLI1（P＜0.05）蛋白均上调;Pei+Pur 组和 Control 组 CyclinD1 蛋白上调（P＜0.05）,Pei+Pur 组和 Control 组 Bcl2 蛋白表达上调（P＜0.001）,Control组的Caspase3蛋白下调（P＜0.05）。（2）平板克隆实验结果显示,与Pei组相比,Control组（P＜0.0001）和Pei+Pur组（P＜0.05）细胞克隆数增多;TUNEL荧光染色法结果显示与Pei组相比,Control组细胞凋亡细胞比例显著低于Pei组（P＜0.0001）,Pei+Pur组凋亡比例低于Pei组（P＜0.05）,流式细胞术检测细胞凋亡结果显示,与Pei组相比,Control组（P＜0.01）和Pei+Pur组（P＜0.05）细胞凋亡比例低于Pei组;流式细胞仪测定细胞周期结果显示,Control组和Pei+Pur组S期细胞均少于Pei组。结论二:贝母辛通过下调Hedgehog信号通路蛋白PTCH1、SMO、GLI1的表达抑制Hedgehog信号通路,从而下调下游目标蛋白CyclinD1,引起S期细胞阻滞进而抑制细胞增殖,可能通过调控下游目标蛋白Bcl2诱导细胞凋亡。研究三 贝母辛对结肠癌皮下荷瘤小鼠抑癌作用及分子机制研究目的:基于Hedgehog信号通路探索贝母辛体内抗结肠癌的作用及其机制。方法:通过裸鼠皮下注射HCT116细胞构建结肠癌皮下瘤小鼠模型,接种细胞14天后,小鼠被随机分为4组:空白对照组（Control组）、贝母辛低剂量组（L,Pei 1.8mg/kg）、贝母辛高剂量组（H,Pei3.6mg/kg）、环靶胺组（Cyc）,每组5只,连续腹腔给药20天,1次/天,每四天称量小鼠体重和测量肿瘤体积,最后测量瘤重,观察贝母辛的药效;HE染色观察肿瘤组织的病理变化;IHC观察Hedgehog信号通路蛋白PTCH1、SMO、GLI1的表达情况;Western blot检测Hedgehog信号通路蛋白PTCH1、SMO、GLI1及下游目标蛋白CyclinD1、Bcl2、Caspase3蛋白的表达情况。结果:（1）与Control组相比,贝母辛高剂量组和环靶胺组的肿瘤体积和肿瘤重量均减小,贝母辛低剂量组无明显变化。（2）肿瘤组织HE染色显示,与Control组相比,贝母辛高剂量组和环靶胺组肿瘤组织坏死部分减少,细胞异型性及核分裂像减少。（3）IHC结果显示,与Control组相比,贝母辛高剂量组（P＜0.01）和环靶胺组（P＜0.001）的PTCH1蛋白的表达弱于对照组,贝母辛高剂量组（P＜0.05）和环靶胺组（P＜0.05）的SMO蛋白的表达弱于对照组,贝母辛低剂量组（P＜0.05）、贝母辛高剂量组（P＜0.01）和环靶胺组（P＜0.05）的GLI1蛋白的表达均明显弱于对照组。（4）WB结果显示,与Control组相比,贝母辛高剂量组（P＜0.01）和环靶胺组（P＜0.001）的CyclinD1蛋白的表达下调,贝母辛高剂量组（P＜0.05）和环靶胺组（P＜0.05）的BCL2蛋白的表达下调,环靶胺组Caspase3蛋白的表达上调（P＜0.05）。与Control组相比,贝母辛高剂量组（P＜0.01）和环靶胺组（P＜0.01）通路蛋白PTCH1被下调,贝母辛低剂量组（P＜0.05）、贝母辛高剂量组（P＜0.01）和环靶胺组（P＜0.01）通路蛋白SMO被下调,贝母辛高剂量组（P＜0.001）和环靶胺组（P＜0.001）通路蛋白GLI1均被下调。结论三:贝母辛可抑制HCT116皮下瘤模型小鼠肿瘤的生长,可能通过Hedgehog信号通路调控肿瘤细胞的增殖和凋亡。总结:贝母辛可抑制HCT116细胞的增殖、侵袭迁移、诱导细胞凋亡,可能通过Hedgehog信号通路下调下游蛋白CyclinD1引起S期细胞阻滞进而抑制细胞增殖,并且可能通过Hedgehog信号通路下调下游蛋白Bc12进而诱导细胞凋亡,从而抑制HCT116皮下瘤模型小鼠肿瘤的生长。