第一章综述 1.1单细胞凝胶电泳技术 单细胞凝胶电泳(singlecellgelelectrophoresisassay，SCGE)义称彗星试验(cometassay)，是一种快速、灵敏的检测单个细胞DNA断裂的技术，由Ostling[1]等于1984年首次提出，并利用该技术在中性条件下检测C射线引起的DNA双链断裂。1988年，Sing[2]等建立了碱性单细胞凝胶电泳技术，该技术不仅可以检测DNA单、双链断裂，还可用来检测碱性不稳定位点、DNA交联和不完全切除修复位点等。1996年，Collins[3]等对该方法进行了进一步改进，并利用核酸内切酶和甲酰胺嘧啶糖基酶分别检测了氧化嘧啶和8-羟基鸟嘌呤的损伤。1997年，Santos[4]等首次将SCGE技术与DNA荧光原位杂交技术(nuoreseenceinsituhybridization，FISH)结合起来，为SCGE技术的应用开辟了新的途径。我国朱志良博士率先在国内建立了彗星-荧光原位杂交技术体系，并利用该技术体系发现人9号染色体是苯代谢产物的靶染色体。 彗星试验方法适用范围广泛，该方法适用于各种体内体外试验，凡是能制成单细胞悬液的各种真核生物细胞均适用于彗星试验，另外彗星试验的独特之处在于，可以检测单细胞的DNA损伤，这就为受试物毒作用的靶细胞定位提供了可能[5，6，7]。 1.1.1SCGE技术原理 当各种内源性和外源性DNA损伤因子诱发细胞DNA链断裂时，DNA的超螺旋结构受到破坏，在细胞裂解液作用下，细胞膜、核膜等膜结构受到破坏，细胞内的蛋白质、RNA以及其他成分均扩散到细胞裂解液中，而核DNA由于分子量太大只能留在原位：中性条件时，DNA片段可进入凝胶发生迁移，而在碱处理和碱性电解质作用下，DNA发生解螺旋，DNA环向外伸展，损伤的DNA断链缺口暴露了阴性电荷，高pH促使DNA变性和解螺旋，从而有利丁单链和双链DNA断片的移动。在电场力作用下，细胞核中带阴性电荷的DNA断片离开核DNA在凝胶分子筛中向阳极移动，形成“彗星”状图像，DNA链缺口越多，进入尾部的DNA越多，表现为尾长和尾部荧光强度增加；未损伤细胞在电泳中DNA仍停留于核中形成圆形荧光团[8，12]。在一定条件下，DNA迁移距离(彗星尾长)和DNA含量(荧光强度)分布与DNA损伤程度呈线性相关，因此，尾矩(尾部DNA的含量与尾长的乘积)被作为SCGE定量分析的主要依据[9，22]。 1.1.2SCGE实验方法 作为检测DNA原始损伤的试验，SCGE试验应用哺乳动物要比细菌试验(DNA修复试验和SOS显色试验)和噬菌体试验更有利于将试验结果外推于动物和人；另一方面它又比同样应用哺乳动物细胞的姊妹染色单体交换实验(SCE)和非程序DNA合成试验(L7DS)的周期人为缩短，不必等到DNA复制和细胞分裂，因此适用于不能增殖的细胞，只要是活的真核细胞就可以用丁本试验。 SCGE根据电泳条件的不同可以分为中性电泳和碱性电泳，中性电泳用于检测DNA双链断裂(DSBs)，只限于研究射线和拟辐射化合物对DNA的损伤作用[1]；而碱性处理可检测SSBs、DSBs和碱性不稳定损伤。据报道许多处理因素造成的SSBs要比DSBs多5～2000倍，因此碱性SCGE大大提高了检测灵敏度。目前该技术在世界上很多实验室应用，操作上不断地进行改良，不断地融进新技术[2]。 SCGE基本操作程序如下： 细胞染毒→细胞悬浮液的制备→载玻片凝胶体的制备→细胞裂解→DNA碱性解旋→DNA电泳→中和→染色→图像观察→数据分析 SCGE样品细胞需要量少，细胞可米自培养的细胞系或从人、动物和植物活体组织分离的细胞，1995年，Daryl[10]等报道用于SCGE分析的原代细胞将近20种，目前已用过的细胞有人的外周血淋巴细胞、表皮细胞、成纤维细胞、睾丸细胞、肿瘤细胞等；动物有肝细胞、血淋巴细胞；植物细胞等。 细胞存活率是一个重要的参数，它用来区分细胞毒性和遗传毒性，国外比较先进的方法是片j溴化乙锭和5,6-二羧基荧光素双乙酸酯的双染料法。5,6-二羧基荧光素双乙酸酯染色后荧光镜检查，活细胞整个呈现绿色，死细胞仅见红核，正在死亡的细胞则只有绿色颗粒而核呈现现红色。国内通常采用台酚兰染色，活细胞不会被染色，而死亡细胞会成监色。一般细胞存活率大于80％时认为受试物没有细胞毒性，可以继续进行试验。但有研究证明台酚兰不能检测细胞活性，它只能说明细胞膜是否完整。最好的检测方法应该是控制对照组细胞不能出现拖尾现象，只能是O级或尾部DNA百分含量在10％左右[11]。 细胞可以冷冻保存，便于日后用于SCGE分析，因为SCGE要求的是DNA保持完整而不是DNA具有的扩增能力，冻存时无需常规冻存方法，只需在培养基或PBS中加入DMSO，-80℃保