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目的:牙齿发育是上皮和间充质之间相互作用的复杂过程,许多转录因子和信号分子参与其中。牙齿发育不良（hypoplasia of teeth）是最常见的颅面先天畸形之一,包括牙齿数目、形状和结构异常。牙齿数目异常,即先天缺牙（congenital tooth agenesis）是牙列中较常见的发育异常。排除第三磨牙缺失,恒牙缺失的发病率为1.6%-9.6%,其中第二前磨牙和侧切牙最容易受累,而乳牙先天缺失的发病率较低。按缺牙数目一般分为少数牙缺失（hypodontia）、多数牙缺失（oligodontia）以及全口无牙（anodontia）。其中,少数牙缺失指先天缺失牙齿数少于6颗,多数牙缺失指牙齿先天缺失6颗及以上（不包括第三磨牙）。牙齿先天缺失可由环境因素或遗传因素造成,临床上可见到散发病例和家族遗传病例,后者可以是常染色体显性遗传、常染色体隐性遗传或X染色体连锁遗传。先天缺牙不仅影响患者的咀嚼功能,而且影响发音、容貌及心理健康。按照是否伴有其他组织器官改变,先天缺牙可分为综合征型和非综合征型。外胚层发育不良综合征（ectodermal dysplasia syndrome,EDs）是临床上最常见的综合征型先天缺牙。患儿除了先天缺牙,还伴发其他外胚层来源组织的发育障碍,分为少汗型（HED）和无汗型两种。大量研究表明,与先天缺牙致病相关的基因有20余种,一般认为PAX9、MSX1、AXIN2和EDA基因与非综合征型先天缺牙密切相关,而最常见的综合征型先天缺牙—外胚层发育不良综合征,其致病基因主要为EDA、EDAR及EDARADD。本研究通过临床检查收集具有外胚层发育不良临床表现的先天缺牙家系6个,针对每个家系对相关候选基因进行检测并初步分析其功能改变,确定外胚层发育不良且先天缺牙患者的致病基因变异位点及分析其可能的致病机制。研究方法:1.收集具有外胚层发育不良临床表现且先天缺牙的患者家系,询问病史并临床检查后绘制家族图谱,收集血液样本,进行第二代全外显子测序（WES）筛查,对筛查结果分析及验证。2.收集EDAR基因c.175-2A>G患者血液样本,提取RNA并逆转录后进行Sanger测序,分析剪切位点变化,RT-PCR检测变异对其转录产物的影响。3.对检测到的EDAR基因c.175-2A>G新变异位点进行引入错配引物设计,应用聚丙烯酰胺凝胶电泳方法检测100个正常人血样DNA,排除SNP,确定其为致病新突变位点。4.致病基因变异对蛋白功能的影响分析:应用功能分析网站SIFT和polyphen-2评估蛋白质功能改变;使用Translate网站（https://web.expasy.org/translate/）分析蛋白质翻译结果。参考NCBI数据库,使用UGENE软件参考相关同源蛋白进行氨基酸保守性分析;应用PSIPRED网站分析蛋白质二级结构改变;使用Swiss-model模拟蛋白质三维结构,分析野生型和变异型EDA蛋白质三维结构变化及其对功能的影响。结果:1.本研究应用高通量测序技术在六个中国汉族先天缺牙家系中筛查到了四个已知致病变异位点和两个新变异位点并进行了实验验证绘制家系图谱,涉及致病基因包括EDA基因、EDAR基因和WNT10A基因。2.在家系一筛查到了一个已知致病变异位点EDA基因c.457C>T错义突变,变异可引起p.Arg153Cys,根据ACMG评级指南判定其为先天缺牙和X连锁少汗型外胚层发育不良的致病基因,临床表现为多数牙缺失,少汗,毛发稀疏,保守性分析结果显示该位点在物种间高度保守,蛋白质分析该变异可能会削弱EDA蛋白产物水解加工,并影响TNF同源结构域的释放。3.在家系二检测到了一个已知的致病变异,先证者携带EDA基因c.895G>A错义变异,变异可引起p.Gly299Ser,根据ACMG评级指南判定其为先天缺牙和X连锁少汗型外胚层发育不良的致病基因,临床表现为多数牙缺失,少汗,毛发稀疏,保守性分析结果显示该位点在物种间高度保守。4.在家系三检测到一个EDA基因新的缺失突变c.954del C缺失突变,变异可引起p.Ala318fs,根据ACMG评级指南判定其为先天缺牙和X连锁少汗型外胚层发育不良的致病基因,临床表现为无牙,毛发稀疏,少汗,视力降低,保守性分析结果显示该位点在物种间高度保守,根据蛋白质分析,该变异可引起氨基酸编码移码,并引起蛋白编码提前终止。5.在家系四检测到了一个WNT10A基因的已知错义突变c.511C>T,变异可引起p.Arg171Cys,根据ACMG评级指南判定其为先天缺牙的致病基因,常染色体显性遗传,临床表现为多数牙缺失。蛋白质分析显示Cys的取代可能会消除R171与相邻残基的静电相互作用。6.家系五检测到了一个EDAR基因新的错义变异c.175-2A>G,根据ACMG评级指南判定其为先天缺牙和少汗型外胚层发育不良的致病基因,常染色体显性遗传,100个正常人检测同位点无变异排除SNP,该变异使得EDAR基因mRNA转录过程中发生了异常剪切,跳过exon4起始部分的22bp,经RT-PCR检测提示新剪切位点的mRNA转录本降解,进而影响蛋白表达和功能,导致了先天缺牙和HED的发生。7.在家系六中检测到了一个EDAR基因的已知错义变异c.442T>C,变异引起p.Cys148Arg,根据ACMG评级指南判定其为先天缺牙和X连锁少汗型外胚层发育不良的致病基因,蛋白质分析该突变位点位于TNFR结构域结尾处,可能影响EDAR蛋白与EDA结合,进而降低蛋白功能,导致了先天缺牙的发生。结论:1.本研究在六个中国汉族外胚层发育不良伴先天缺牙家系中发现了两个EDA基因的已知变异位点,一个EDA基因的新变异位点,一个EDAR基因的新变异位点,一个EDAR的已知变异位点以及一个WNT10A基因的已知变异位点。2.EDA基因c.954del C（p.Ala318fs）杂合缺失变异导致HED和先天缺牙的发生。3.EDAR基因c.175-2A>G杂合变异导致HED和先天缺牙的发生。4.本研究通过高通量测序技术发现了先天缺牙及外胚层发育不良新的致病突变位点,丰富了基因突变数据库,并针对致病基因突变导致的蛋白功能异常进行了分析,为该病患者家系成员提供了遗传咨询和优生指导。