前言：　　肝性脑病（Hepatic encephalopathy，HE）是各种严重肝病所致的以代谢紊乱为基础的中枢神经系统功能失常综合征，其主要临床表现为性格改变、智力减退、意识障碍、行为失常和昏迷等。HE发病机制尚未完全阐明，有很多假说，其中氨中毒假说在HE的发病机制中占主要地位，降血氨是治疗HE的有效措施之一。　　HE的病理变化以星形胶质细胞病变为主。星形胶质细胞在胶质细胞中数量最多，体积最大。其胞体呈星形，并向外伸出放射状突起伸展充填于神经元之间，包裹神经元的突触区域，同时其终足又包绕毛细血管，脑内毛细血管表面85％～99％被星形胶质细胞的突起所覆盖。因此星形胶质细胞在脑能量代谢中发挥重要作用。　　肝功能衰竭时，机体内氨生成过多而肝脏对氨的清除能力降低，致使血氨浓度显著增高，高浓度的血氨通过血脑屏障进入脑组织，引起脑功能障碍。因为与鸟氨酸循环有关的酶在脑内不表达，所以脑中清除氨主要依靠谷氨酰胺合成这一途径。谷氨酰氨合成酶（glutamine synthetase，GS）主要存在于星形胶质细胞，因此星形胶质细胞是脑中清除氨的主要细胞，是氨解毒的主要场所。　　HE能影响大脑能量代谢。很多研究显示，氨能刺激糖酵解，增加糖酵解代谢途径中的酶，如磷酸果糖激酶、烯醇化酶、三磷酸甘油醛脱氢酶和丙酮酸激酶活性。但高氨条件下，这些酶活性增加是否与其mRNA及蛋白表达有关，目前还不清楚。　　己糖激酶(hexokinase，HK)是糖酵解途径的第一个限速酶，在哺乳动物组织中有四种类型，即HKⅠ-Ⅳ。Ⅰ型:是葡萄糖依赖的组织如脑组织主要的同工酶。Ⅱ型:主要存在骨骼肌和其它胰岛素敏感的组织。Ⅲ型:除猪红细胞外，还没有发现在其它组织占优势。Ⅳ型:又称葡萄糖激酶，主要存在肝和胰腺β-细胞。　　磷酸果糖激酶(Phosphofructokinase，PFK)是调节糖酵解过程的几个限速酶中最重要的酶。在哺乳动物，PFK的活化型是由三个不同亚基任意结合形成同源或异源具有不同变构效应和催化特性的四聚体。这三个亚基类型分别是PFK-A(musle)、PFK-B(liver)、PFK-C(brain)。　　丙酮酸激酶(Pyruvate-kinase，PK)调节糖酵解流量的作用仅次于PFK，是糖酵解过程中最后一个限速酶，它催化磷酸烯醇式丙酮酸形成丙酮酸。在哺乳动物，PK由两个平行基因（PKLR和PK-M）编码，每个基因可被选择性剪接，共形成四个PK亚型。L和R亚型来源于PKLR基因，由不同的启动子控制，分别特异性表达在肝和红细胞。PK-M基因包含12个外显子，9和10外显子以一个相互排斥的方式被选择性剪接，形成PK-M1和PK-M2亚型。PK-M1主要表达在分化成熟的组织和细胞，如肌肉、心脏和脑细胞，而PK-M2则表达在癌细胞以及胚胎和未分化的组织。　　丙酮酸脱氢酶复合体(pyruvate dehydrogenase complex，PDHC)是一个线粒体多成分酶系，能不可逆地催化丙酮酸氧化脱羧形成乙酰CoA，在能量代谢调控过程中起着关键作用。哺乳动物PDHC由三个催化蛋白组成，即丙酮酸脱氢酶(E1)、二氢硫辛酸乙酰转移酶(E2)、二氢硫辛酸脱氢酶(E3)。PDHC其它的蛋白还包括两个调节蛋白和一个功能未知的蛋白X。PDH E1是焦磷酸硫胺素依赖性的酶，催化丙酮酸开始脱羧。它是一个四聚体，由两个相同的α亚基和两个相同的β亚基组成。α亚基又分为α1和α2两种亚型，α1是编码体细胞的亚型，位于X染色体，α2无内含子，只表达在生精细胞，位于常染色体。　　丙酮酸羧化酶（pyruvate carboxylase，PC）存在于线粒体中。在脑内，PC特异性表达在星形胶质细胞，能不可逆地催化丙酮酸形成草酰乙酸，在三羧酸循环中，这是供给草酰乙酸的主要补充反应。PC是核编码的线粒体酶，是由4个相同的亚基组成的同源四聚体。在中枢神经系统，PC与谷氨酸、γ-氨基丁酸等神经递质库的补给有关。　　方法：　　采用原代培养的小鼠星形胶质细胞、小脑颗粒神经元以及皮层神经元，分别用NH4Cl处理2h-5d，用RT-PCR和免疫印迹方法检测NH4Cl对葡萄糖转运体1(GLUT1)及糖酵解时一些关键酶如己糖激酶1(HK1)、丙酮酸激酶-M亚型(PK-M)、磷酸果糖激酶-A(PFK-A)、丙酮酸脱氢酶E1α1亚单位(PDH-α1)、丙酮酸羧化酶(PC)的mRNA和蛋白表达变化。使用SPSS12.0软件进行统计学分析，多组资料用one-way ANOVA方法进行比较，P＜0.05表示差异具有统计学意义。　　结果：　　1、NH4Cl对星形胶质细胞乳酸生成的影响　　1mM、3mM、5mM NH4Cl处理星形胶质细胞4h-3d，各剂量组都可引起乳酸生成增加。NH4Cl处理2h和5d时，对星形胶质细胞乳酸生成基本无影响。　　2、在NH4Cl作用下，GLUT1、HK1、PK-M、PFK-A、PDH-α1、PC mRNA在星形胶质细胞的表达。　　NH4Cl对星形胶质细胞糖酵解关键酶mRNA作用的浓度曲线和时间曲线显示，1mM、3mM、5mM NH4Cl处理星形胶质细胞2天，PK-M、PFK-A mRNA表达增加，在3mM、5mM NH4Cl作用下，PDH-α1 mRNA表达增加。3mM NH4Cl处理星形胶质细胞，1-5 d时间段，PK-M mRNA表达增加，12h-5d时间段，PFK-A、PDH-α1mRNA表达增加。不同浓度NH4Cl处理星形胶质细胞，在不同时间段，GLUT1、HK1、PC mRNA表达无变化。　　3、小鼠腹腔注射尿素酶，大脑PK-M、PFK-A、PDH-α1mRNA的表达　　小鼠腹腔注射尿素酶4d，大脑PK-M、PFK-A、PDH-α1mRNA表达开始增加，PK-M、PFK-A持续到第7d，PDH-α1持续到第8天。在1-3d时间段，大脑PK-M、 PFK-A、PDH-α1 mRNA表达无变化。　　4、在NH4Cl作用下，星形胶质细胞PK-M、PFK-A、PDH-α蛋白表达　　3mMNH4Cl处理星形胶质细胞2d，PK-M、PFK-A、PDH-α1蛋白表达增加。　　5、在NH4Cl作用下，小脑颗粒神经元和皮层神经元PK-M、PFK-A、PDH-α1 mRNA的表达　　3mMNH4Cl处理小脑颗粒神经元3d，PDH-α1 mRNA表达增加，PK-M、PFK-AmRNA表达无变化。3 mM NH4Cl处理皮层神经元2d和3d时，PK-M、PFK-AmRNA表达增加，在1-3 d不同时间段，PDH-α1 mRNA表达无变化。　　6、在NH4Cl作用下，小脑颗粒神经元和皮层神经元PK-M、PFK-A、PDH-α1蛋白的表达　　3mMNH4Cl处理小脑颗粒神经元3天，PK-M、PFK-A、PDH-α1蛋白表达无变化。3mMNH4Cl处理皮层神经元3天，PFK-A蛋白表达增加，PK-M、PDH-α1蛋白表达无变化。　　讨论：　　葡萄糖跨膜转运是依赖葡萄糖转运体(glucose transport，GLUT)来实现的，现已发现5种葡萄糖转运体(GLUT1-5)，它们分别在不同的组织细胞中起作用。在中枢神经系统，血管内皮细胞和星形胶质细胞主要表达GLUT1。GLUT1表达受多种因素调控。我们用NHaCl处理原代培养的星形胶质细胞，没有发现GLUT1 mRNA表达发生变化。　　很多研究显示，氨能刺激糖酵解，增加糖酵解代谢途径中的酶，如磷酸果糖激酶、烯醇化酶、三磷酸甘油醛脱氢酶和丙酮酸激酶活性。但本课题首次从mRNA和蛋白表达水平证明，氨确实能增强糖酵解代谢。在NH4Cl作用下，星形胶质细胞糖酵解限速酶PK-M、PFK-A mRNA和蛋白表达增加，HK1 mRNA表达无变化;在腹腔注射尿素酶的小鼠脑中，PK-M、PFK-A mRNA表达也增加。这些结果和Ratnakumari和Murthy在整体脑研究发现相一致，他们用醋酸氨处理大鼠，观察到大脑皮层、小脑和脑干糖酵解限速酶PK、PFK活性增加，HK活性没有变化。同时我们也发现，在NH4Cl作用下，星形胶质细胞乳酸生成增加，在PK-M、PFK-A mRNA表达没有变化之前，乳酸生成增加就已经开始。　　星形胶质细胞由于其特殊的超微结构，使其在脑能量代谢中发挥重要作用。在原代培养的星形胶质细胞，氨能明显增加乳酸生成，降低丙酮酸/乳酸比率，但在神经元，氨却没有作用。我们的实验结果也显示，在NH4Cl作用下，除皮层申经元PFK-A mRNA和蛋白表达增加外，小脑颗粒神经元PK-M、PFK-A mRNA和蛋白表达无变化。　　在原代培养的星形胶质细胞，通过测量来自[1-14C] pyruvate的14CO2形成，发现氨能抑制丙酮酸脱羧。这是因为氨能阻碍苹果酸-天冬氨酸穿梭，降低线粒体草酰乙酸的利用率，影响TCA循环运行。由于草酰乙酸缺乏，导致乙酰CoA蓄积，乙酰CoA可抑制丙酮酸脱羧。在神经元，氨对丙酮酸脱羧没有作用。在实验中我们也发现，在NH4Cl作用下，星形胶质细胞PDH-α1 mRNA和蛋白表达增加，在腹腔注射尿素酶的小鼠脑中，PDH-α1 mRNA表达也增加。在皮层神经元和小脑颗粒神经元，PDH-α1蛋白表达却没有变化。　　在高氨血症动物脑中，丙酮酸羧化作用增强。用氨处理星形胶质细胞，也发现PC介导的流量增加，即谷氨酰胺浓度增加，这是因为谷氨酸合成与PC活性有关，而谷氨酸是谷氨酰胺的前体物质。在实验中，我们用NH4CI处理星形胶质细胞，没有发现PC mRNA表达发生变化。　　结论：　　在原代培养的小鼠大脑星形胶质细胞，NH4Cl能增加PK-M、PFK-A、PDH-α1mRNA和蛋白表达。　　前言：　　锂盐治疗双相情感障碍最主要的机制是“肌醇消耗”假说。最初认为低浓度锂盐通过对肌醇单磷酸酶（inositol monophosphatase，IMPase）和肌醇多磷酸-1-磷酸酶(inositol polyphosphate(l)-phosphatase，IPPase)的非竞争性抑制作用，使参与磷酯酶C(phospholipase C，PLC)信号传导的肌醇再生减少。此后研究发现锂盐介导肌醇消耗的另一个机制:锂盐慢性作用可抑制星形胶质细胞对肌醇的摄取。由于脑内只有内皮细胞可以合成肌醇，神经元或胶质细胞从细胞外摄取肌醇以维持细胞内肌醇水平就显得尤为重要。　　“肌醇消耗”假说不能完全解释锂盐对双相情感障碍躁狂相和抑郁相均有效的现象。一些研究发现，在肌醇水平较高时锂盐才可抑制星形胶质细胞瘤细胞对肌醇的摄取;而肌醇浓度低时，锂盐的慢性处理可引起细胞对肌醇的摄取增加。这可能与星形胶质细胞摄取肌醇的过程中有两个肌醇摄取载体参与有关:高亲合力的Na+-依赖性肌醇转运体（Na+-dependent inositol transporter, SMIT）和低亲合力的H+-依赖性肌醇转运体(H+-dependent inositol transporter, HMIT)。SMIT在pH较高时活性增加，而HMIT则在pH增加时活性降低。根据SMIT和HMIT在不同PH值条件下活性的变化，我们推测肌醇摄取的双向调节可能为药物治疗躁狂抑郁双相情感障碍的作用机理。　　在本研究中，我们将观察在细胞外液不同pH值和不同的肌醇浓度时，对星形胶质细胞肌醇摄取的影响以及对细胞稳态pHi的影响，证明细胞内pHi不同和细胞外液肌醇浓度不同，是否会对肌醇摄取产生影响，进一步阐明锂盐治疗双向情感障碍的作用机制。　　方法：　　采用原代培养的小鼠星形胶质细胞，用不同浓度NH4Cl或不同pH值的培养液处理1小时，用5μM BCECF-AM进行荧光负载，以进行星形胶质细胞稳态pHi的检测。或者把[3H]inositol加到培养液中(0.5μCi/ml)，孵育细胞1小时后，进行液闪计数和蛋白测定。采用one-way ANOVA方法进行多组间结果比较。P＜0.05表示具有统计学意义。　　结果：　　1、细胞外液不同pH值和不同浓度NH4Cl对星形胶质细胞稳态pHi的影响　　原代培养的星形胶质细胞培养成熟后，放在pH值分别为6.0、6.5、7.4和8.0的培养液中，BCECF荧光负载孵育细胞1小时，测得的细胞内pH值分别为6.37、6.78、7.11、7.38。可见，pHi随着pHo的变化而变化，但由于细胞pHi的调节功能，pHi的变化幅度显著低于pHo的变化幅度。用0，2.5 mM，5 mM，7.5 mM和10mM NH4Cl处理星形胶质细胞，细胞内pHi分别是7.12，6.85，6.75，6.76和6.72，说明NH4Cl在星形胶质细胞引起浓度依赖性细胞酸化。　　2、细胞外液pH值与肌醇浓度对肌醇摄取的影响　　培养液肌醇浓度100μM时，细胞肌醇摄取率在pH6.5(510 pmol/mg/min)明显高于pH8.0（416 pmol/mg/min），说明在高浓度肌醇时，细胞酸化显著增加肌醇摄取。　　3、培养液中含有不同浓度的NH4Cl时，对星形胶质细胞摄取肌醇的影响　　在中(25μM)、低(10μM)浓度肌醇时，NH4Cl引起的细胞内酸性化显著降低肌醇的摄取。　　4、SMIT抑制剂phloridzin(PZ，50μM)对星形胶质细胞肌醇摄取的影响　　在低浓度(10μM)肌醇情况下，细胞内酸性化显著降低肌醇摄取，使用低浓度PZ抑制SMIT后，肌醇摄取率则无明显差异，显示HMIT不参与上述变化。　　5、高浓度PZ(3 mM)对星形胶质细胞摄取肌醇的影响　　高浓度PZ(3 mM)抑制SMIT和HMIT，此时肌醇摄取为被动扩散，此实验证实肌醇的被动扩散速度很低，并且呈浓度依赖性。　　讨论：　　本课题通过测定1小时[3H]myo-inositol的积累做为肌醇摄取率，来研究细胞外液不同肌醇浓度及不同的细胞内pHi时，原代培养的星形胶质细胞对肌醇的摄取作用。　　我们用pH为6.5、7.4、8.0的培养液孵育星形胶质细胞1小时，测得的细胞内稳态pHi分别为6.78、7.11、7.38。尽管培养液pH已达8.0，但由于星形胶质细胞自身的pHi调节功能，细胞并没有被相应的碱化。在培养液肌醇浓度10μM，pH分别为6.5、8.0、7.4时，各组间星形胶质细胞肌醇摄取率变化不大，但随着肌醇浓度加大，肌醇摄取率在pH6.5时高于pH8.0，尤其在培养液肌醇浓度100μM时，这种差距明显加大。这说明，在细胞酸化时，随着肌醇浓度加大，低亲和力的HMIT活性增强，对肌醇的摄取增加。　　我们用pH为6.0的培养液孵育星形胶质细胞1小时，测得的细胞内稳态pHi分别为6.37。在培养液肌醇浓度10μM时，肌醇摄取率在pH6.0时明显低于pH7.4，这个结果表明，在细胞酸化，细胞外肌醇处于低水平时，高亲和力的SMIT肌醇摄取活性降低，对肌醇的摄取减少，用不同浓度的NH4Cl处理1小时，能引起星形胶质细胞酸化，也可得到相似的结果。用竞争性Na+-依赖性肌醇转运抑制剂PZ（50μM）抑制SMIT，在pH7.4和6.0时的肌醇摄取率都明显下降，并且都降到几乎相等的水平。这是由于PZ抑制了SMIT，此时的肌醇肌醇摄取率代表的是HMIT，HMIT和肌醇亲和力低，虽然它在酸性条件下活性增加，但在细胞外肌醇处于低水平时，限制了其摄取肌醇作用的发挥。　　用高浓度PZ(3 mM)抑制SMIT和HMIT后，此时的肌醇摄取率应该代表的是细胞外肌醇自由弥散到细胞内的肌醇量。由于量较少，约为肌醇摄取的2％，在本课题中，忽略不计。　　“锂盐治疗双相情感障碍最主要的机制是“肌醇消耗”假说，但该假说不能解释锂盐在临床上对双向情感障碍患者躁狂期和抑郁期都有效这一现象。因此我们提出“锂盐慢性处理可使星形胶质细胞碱化，从而双向性调节细胞对肌醇的摄取，以维持细胞内肌醇含量的恒定和IP3信号系统的正常功能”的假说。本课题的实验结果支持这个假说，为这个假说的进一步完善提供了实验和理论依据，也进一步阐明了锂盐治疗双向情感障碍的作用机制。　　结论：　　在细胞碱性化，细胞外肌醇处于低水平时，高亲和力的SMIT活性增强，对肌醇的摄取增加;低亲和力的HMIT，在细胞碱性化，细胞外肌醇处于高水平时，对肌醇的摄取减少。这些结果说明，细胞内pHi变化，确实可双向性调节肌醇摄取，也表明锂盐通过引起星形胶质细胞碱化对两种肌醇转运体活性进行调节，从而双向性调节肌醇摄取，使双相情感障碍患者脑内异常升高或降低的肌醇水平恢复正常。