目的:本研究利用分子生物学技术,通过体内实验,观察UV辐照导致光老化模型小鼠皮肤组织TGF-β/Smad信号通路及MMPs/TIMPs系统和相关细胞因子的影响,部分阐明光老化皮肤细胞外基质降解的作用途径,完善皮肤光老化的发生机制;并以桃红四物汤为载体,研究光老化的证候病机,探索“血瘀”光老化的物质基础;研究桃红四物汤在防治皮肤光老化过程中的作用机制,以期对桃红四物汤防治皮肤光老化有更加全面充分的认识,为中医药防治皮肤光老化提供新的理论依据。材料与方法:采用昆明小鼠60只,随机分为6组,每组10只,即空白对照组、模型对照组、中药低剂量组、中药中剂量组、中药高剂量组和VE组。空白对照组只剃毛不予其它处理,模型对照组灌服生理盐水,中药高中低剂量组灌服不同浓度的桃红四物汤为处理因素,VE组灌服维生素E为阳性对照药物。除空白对照组外其余各组于造模前30分钟灌胃后进行紫外线照射。采用UVA+UVB光源(40W紫外线灯管:UVB灯管5根,UVA灯管2根)照射小鼠背部皮肤制备小鼠皮肤光老化模型。每只小鼠均用电推剪剪除背部1.5×1.5cm区域内毛发(以后每隔2日剃毛一次),放置于自制紫外线灯箱中进行照射。每周照射3次,共14周。第15周断颈处死全部小鼠后,取背部正中全层皮肤组织检测以下指标:酶联免疫吸附法(ELISA)法检测小鼠血清中IL-1及TNF-α、TGF-β含量;RT-PCR法检测小鼠皮肤组织中Smad2/3、MMP-1、MMP-3、MMP-12、TIMP-1、TIMP-2 m RNA的表达;Western-blot法检测皮肤组织中Smad2/3、MMP-1、MMP-3、MMP-12、TIMP-1、TIMP-2蛋白表达。结果:模型对照组小鼠14周后出现倦怠、蜷缩、活动减少、皮肤枯萎干燥、粗糙肥厚、纹理粗大、色暗红或有瘀斑等血瘀证为主的表现符合光老化模型标准。1.ELISA法检测结果(1)TNF-α、IL-1水平与空白对照组比较,模型对照组TNF-α、IL-1的含量显著上调,差异具有统计学意义(P<0.01);与模型对照组比较,中药高、中、低剂量组TNF-α、IL-1的含量显著下调,差异具有统计学意义(P<0.01);与VE组比较,中药中、低剂量组的TNF-α、IL-1的含量上调,差异具有统计学意义(P<0.01),而中药高剂量组差异不具有统计学意义(P>0.05)。(2)TGF-β含量与空白对照组比较,模型对照组中的TGF-β含量显著下调,差异有统计学意义(P<0.01);与模型对照组比较,中药低、中、高剂量组TGF-β含量显著上调,差异有统计学意义(P<0.01);与VE组相比,中药中、高剂量组TGF-β含量下调,差异具有统计学意义(P<0.05,P<0.01),而中药低剂量组差异不具有统计学意义(P>0.05)。2.RT-PCR法各组检测结果(1)Smad m RNA表达(1)Smad-2 m RNA:与空白对照组比较,模型对照组皮肤组织中Smad-2 m RNA表达水平显著下调,差异有统计学意义(P<0.01);与模型对照组比较,中药低、中、高剂量组皮肤组织中Smad-2 m RNA表达水平显著上调,差异有统计学意义(P<0.01);与VE组相比,中药低剂量组Smad-2 m RNA表达水平显著下调(P<0.01),中药中剂量组Smad-2m RNA表达水平显著下调(P<0.05),差异具有统计学意义,而中药高剂量组差异不具有统计学意义(P>0.05)。(2)Smad-3 m RNA表达:与空白对照组比较,模型对照组Smad-3 m RNA表达水平显著下调,差异有统计学意义(P<0.01);与模型对照组比较,中药中、高剂量组Smad-3 m RNA表达水平显著上调,差异有统计学意义(P<0.01);与VE组比较,中药低剂量组的Smad-3m RNA表达水平显著下调(P<0.01),中药中剂量组的Smad-3 m RNA表达水平显著下调(P<0.05),差异具有统计学意义,而中药高剂量组差异不具有统计学意义(P>0.05)。(2)MMPs m RNA表达MMP-1、MMP-3、MMP-12 m RNA表达与空白对照组比较,模型对照组MMP-1、MMP-3、MMP-12 m RNA表达水平显著上调,差异有统计学意义(P<0.01);与模型对照组比较,中药低、中、高剂量组皮肤组织中MMP-1、MMP-3、MMP-12 m RNA表达水平显著下调,差异有统计学意义(P<0.01);与VE组相比,中药低、中剂量组MMP-1、MMP-3、MMP-12 m RNA表达水平显著上调,差异具有统计学意义(P<0.01),中药高剂量组差异不具有统计学意义(P>0.05)。(3)TIMPs m RNA表达(1)TIMP-1 m RNA与空白对照组比较,模型对照组TIMP-1 m RNA表达水平显著下调,差异有统计学意义(P<0.01);与模型对照组比较,中药各剂量组TIMP-1 m RNA表达水平显著上调,差异具有统计学意义(P<0.01);与VE组比较,中药低剂量组的TIMP-1 m RNA表达水平显著下调(P<0.01),中药中剂量组的TIMP-1 m RNA表达水平显著下调(P<0.05),差异具有统计学意义,而中药高剂量组的差异不具有统计学意义(P>0.05)。(2)TIMP-2 m RNA与空白对照组比较,模型对照组TIMP-2 m RNA表达水平显著下调,差异有统计学意义(P<0.01);与模型对照组比较,中药各剂量组TIMP-2 m RNA表达水平显著上调,差异具有统计学意义(P<0.01);与VE组比较,中药中、低剂量组的TIMP-2 m RNA表达水平显著下调(P<0.01),差异具有统计学意义,而中药高剂量组的差异不具有统计学意义(P>0.05)。3.Western Blot法各组检测结果(1)Smad蛋白表达(1)Smad-2蛋白表达:与空白对照组比较,模型对照组Smad-2蛋白表达水平降低,差异有统计学意义(P<0.01);与模型对照组比较,中药高、中、低剂量组Smad-2蛋白表达水平显著上调,差异具有统计学意义(P<0.01);与VE组比较,中药低剂量组Smad-2蛋白表达水平显著下调(P<0.01),中药中剂量组Smad-2蛋白表达水平显著下调(P<0.05),差异具有统计学意义,而与中药高剂量组的差异不具有统计学意义(P>0.05)。(2)Smad-3蛋白表达与空白对照组比较,模型对照组Smad-3蛋白表达水平降低,差异有统计学意义(P<0.01);与模型对照组比较,中药高、中剂量组Smad-3蛋白表达水平显著上调,差异具有统计学意义(P<0.01);与VE组比较,中药低剂量组Smad-3蛋白表达水平显著下调(P<0.01),中药中剂量组Smad-3蛋白表达水平显著下调(P<0.05),而与中药高剂量组的差异不具有统计学意义(P>0.05)。(2)MMPs蛋白表达与空白对照组比较,模型对照组小鼠MMP-1、MMP-3、MMP-12蛋白表达水平显著升高(P<0.01);与模型对照组相比,中药各剂量组中的MMP-1、MMP-3、MMP-12蛋白表达水平显著降低,差异有统计学意义(P<0.01);与VE组比较,中药中、低剂量组MMP-1、MMP-3、MMP-12蛋白表达显著高于VE组,差异有统计学意(P<0.01),而与中药高剂量组的差异不具有统计学意义(P>0.05)。(3)TIMPs蛋白表达(1)TIMP-1蛋白表达与空白对照组相比,模型对照组小鼠TIMP-1蛋白表达降低,差异有统计学意义(P<0.01);与模型对照组相比,中药高、中、低剂量组TIMP-1蛋白表达显著升高,差异有统计学意义(P<0.01);与VE组比较,中药低剂量组TIMP-1蛋白表达水平显著下调(P<0.01),中药中剂量组TIMP-1蛋白表达水平显著下调(P<0.05),差异具有统计学意义,而与中药高剂量组的差异不具有统计学意义(P>0.05)(2)TIMP-2蛋白表达与空白对照组相比,模型对照组小鼠TIMP-2蛋白表达降低,差异有统计学意义(P<0.01);与模型对照组相比,中药高、中、低剂量组TIMP-2蛋白表达显著升高,差异有统计学意义(P<0.01);与VE组比较,中药中、低剂量组TIMP-2蛋白表达水平显著下调(P<0.01),差异具有统计学意义,而与中药高剂量组的差异不具有统计学意义(P>0.05)。结论:1.以活血化瘀法为治法选用桃红四物汤防治皮肤光老化疗效确切,以高剂量口服疗效最佳。2.紫外线辐射能诱导皮肤组织产生炎症因子IL-1和TNF-α,通过复杂的信号转导通路调控,最终导致MMPs增加,致使胶原蛋白等细胞外基质降解加速;同时阻碍TGF-β/Smads信号通路的信号转导,进而使胶原合成减少,出现皮肤光老化。其中MMP-1、MMP-3、MMP-12均参与降解细胞外基质的过程,皮肤光老化与MMPs/TIMPs的平衡关系失调有关。3.桃红四物汤能降低光老化小鼠皮肤组织中炎症因子的表达,减少MMP-1、MMP-3、MMP-12生成,同时增加TIMP-1、TIMP-2含量,恢复MMPs/TIMPs表达平衡,减少胶原蛋白等细胞外基质降解来防治光老化。4.桃红四物汤还通过调控TGF-β/Smads信号转导通路,增加胶原合成来达到防治皮肤光老化的目的。