目的:原发性肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一,具有起病隐匿、进展迅速、转移复发较快、生存期短等特点。目前常规疗法多为通过手术、放射或化学疗法杀灭肿瘤细胞,但研究发现经治疗后残余细胞能诱导刺激机体产生促炎细胞因子,而这些信号分子能促进肿瘤生长,刺激肿瘤复发,影响肿瘤治疗效果。由此可见,肝肿瘤的发生机制与炎症关系密切,并通过调控炎症相关通路、免疫细胞分泌一系列细胞因子,促进肝肿瘤的形成;炎症微环境通过对不同环境因子的表观遗传转化可以直接促进肝祖细胞的激活,加速肿瘤形成。片仔癀(PIEN TZE HUANG)为一种具有清热解毒、凉血化瘀、消肿止痛功效的中成药,临床可用于治疗急慢性肝炎,现代药理学研究发现其具有良好的抗炎及抗肿瘤作用。因此在现有文献和前期工作基础上本课题提出以下科学假设,认为片仔癀可能通过调控炎症相关通路、特异性促炎症消退介质的代谢,抑制小鼠肝移植瘤发生、发展,进而产生抗炎、抗肿瘤作用,为片仔癀防治肝癌提供科学依据。方法:1片仔癀对小鼠肝移植瘤的治疗作用研究建立H22肝癌细胞小鼠皮下肝移植瘤模型,待造模成功后按照分层随机法将其分为模型组、索拉非尼组、片仔癀高剂量组、片仔癀中剂量组、片仔癀低剂量组和空白组共6组,各给药组每天灌胃相应剂量的片仔癀和索拉非尼,连续给药14d,正常组和模型组每天灌胃等体积生理盐水。观察并记录各组动物一般情况观察,测量移植瘤大小、称量移植瘤质量并抑瘤率;ELISA法检测血清炎症因子IL-6、TNF-α、IL-1β表达水平;肿瘤组织病理学检测,观察组织病理特点。2蛋白组学检测及生物信息学分析实验采用Full Moon公司芯片和芯片配套试剂盒,提取移植瘤组织蛋白、测定蛋白浓度、标记蛋白后采用PEX100抗体芯片进行检测,识别芯片上多条信号通路中关键蛋白位点的磷酸化状态和非磷酸化状态;对信号值校正计算后获得该磷酸化位点蛋白的磷酸化水平;采用Ingenuity Pathway Analysis(IPA)平台对蛋白组学检测数据进行分析,对与肝癌相关的、符合条件的通路进行归类,并根据蛋白质与蛋白质的相互作用算法生成网络,建立了与已识别的差异蛋白相关的肿瘤增殖相关通路、炎症相关通路和细胞周期相关通路及通路网络;对蛋白组学检测典型结果进行初步验证,测定片仔癀对H22细胞活力、肿瘤组织细胞因子表达水平、肿瘤细胞周期等影响。3代谢组学检测及生物信息学分析建立并优化特异性促炎症消退介质(SPMs)及其前体脂肪酸LC-MS/MS液质联用检测方法,通过对血清样本、色谱柱、洗脱系统和检测条件进行优化,最终确定样本处理方法,对血清SPMs进行检测;使用ELISA试剂盒检测Resolvin D1、Resolvin D3、Resolvin D5、Resolvin D6、Resolvin E1、Resolvin E2、Resolvin E3、18S-Resolvin E1蛋白血清表达;结合部分蛋白组学检测数据,利用IPA平台构建包括由片仔癀调控的细胞因子、SPMs、信号通路和关键蛋白在内的分子网络。结果:1片仔癀对小鼠肝移植瘤的治疗作用研究片仔癀对肝移植瘤小鼠肿瘤体积、重量具有抑制作用。与模型组相比,口服给予索拉非尼及不同剂量片仔癀后,肝移植瘤重量和体积均有所降低,其中片仔癀中剂量组较之其他剂量疗效更为显著;而索拉非尼作为阳性药物,作用于肝移植瘤后重量约减少约80%。片仔癀可降低血清细胞因子表达水平。血清ELISA检测结果显示,与空白组相比,模型组各炎症因子均有显著升高,给予索拉非尼和不同剂量片仔癀治疗后,IL-6、TNF-α、IL-1 β表达均有下降趋势,但与模型组相比,片仔癀高剂量组IL-6表达下降无统计学差异;片仔癀高剂量组和片仔癀低剂量组IL-1 β下降无统计学差异。片仔癀可减少移植瘤组织炎细胞浸润。移植瘤组织HE染色结果显示,与模型组相比,不同剂量片仔癀均可以减少炎细胞浸润,改善质核比。2蛋白组学检测及生物信息学分析采用PEX100蛋白芯片检测模型组、Sora组和片仔癀组小鼠移植瘤组织间磷酸化蛋白水平,扫描图像显示微阵列各位点响应良好,数据质量可信。共在肝移植瘤组织中鉴别了 584个磷酸化蛋白位点,其中索拉非尼治疗后68个位点被上调,19个被下调;片仔癀治疗后,87个上调,11个下调。IPA通路分析结果显示,在-log(p-value)>3.0范围内鉴别出20条与肝癌相关的通路,其中炎症相关通路11条,肿瘤增殖相关通路4条,细胞周期相关通路5条。蛋白-通路网络互作分析结果显示,炎症通路相关的蛋白网络包括68种不同的磷酸化蛋白,其中片仔癀可单独调控33种磷酸化蛋白,索拉非尼可单独调控17个磷酸化蛋白。片仔癀可调控炎症相关通路中关键蛋白磷酸化水平,如上调NF-κB、IKKβ、XIAP,下调STAT3,MAPK8,它们主要富集在IL-6、TNFR1、TNFR2等信号通路上;在肿瘤增殖相关通路分子网络中,发现46个磷酸化蛋白,其中14个蛋白受索拉非尼单独调控,14个蛋白受片仔癀单独调控。两种药物均对TP53、ABL、PAK2等关键蛋白有影响,但索拉非尼上调与激酶活性相关的蛋白较多,主要富集于p53通路和FAK通路;细胞周期相关的分子网络包含42种不同的磷酸化蛋白,其中片仔癀单独调控13个蛋白,通过调控MDM2、CHEK1和TP53等蛋白磷酸化,介导G2/M期细胞周期阻滞,而索拉非尼单独调控14个蛋白,通过调控CDKN1B、RB1、HDAC1和HDAC6等蛋白磷酸化,影响G1/S期细胞周期阻滞。对蛋白组学部分结果进行验证,移植瘤组织ELISA检测结果显示,与模型组相比,索拉非尼组TNF-α表达降低,IL-6变化则无统计学差异;片仔癀组IL-6、TNF-α表达均降低;CCK-8试剂盒检测结果显示,片仔癀对H22细胞增殖具有抑制作用,且具有剂量依赖性;流式细胞术对细胞周期检测结果结合移植瘤组织免疫组化结果可见,与模型组相比,经片仔癀治疗后GADD45 α表达升高,Ki67表达降低,片仔癀可以通过介导G2/M期细胞阻滞抑制细胞增殖。3片仔癀治疗肝移植瘤代谢组学检测及IPA分析片仔癀治疗肝移植瘤血清SPMs及其前体检测结果显示,对空白组、模型组、片仔癀组小鼠的血清样本进行处理,经LC-MS/MS靶向检测到5种成分,即19(20)EpDPE、Arachidonic acid、17(S)-HDHA、6(17)-EpDPE 和 15-OxoETE,定量分析血清中SPMs及其前体脂肪酸的含量。相较于空白组,模型组中19(20)-EpDPA和17(S)-HDHA水平升高或有升高趋势,其中19(20)-EpDPA与空白组相比有显著性差异;而17(S)-HDHA虽然在模型组中水平有升高趋势,但与空白组相比在统计学上没有显著差异。模型组中和15-OxoETE、Arachidonic acid 和 16(17)-EpDPE 相较于空白组,水平降低,其中 Arachidonic acid在两组中存在显著性差异。在经片仔癀治疗后,模型组中已经升高的19(20)-EpDPA和17(S)-HDHA有下降趋势,但在统计学上没有显著差异;经片仔癀治疗后,模型组中表达降低的Arachidonic acid(AA)和16(17)-EpDPE有升高趋势,但不存在统计学上的显著差异。对模型组中水平降低的15-OxoETE,只有片仔癀低剂量组具有升高趋势,但不存在统计学差异。Resolvins ELISA 检测结果显示,Resolvins 亚型中 Resolvin D1、Resolvin D3、Resonvin E1和Resolvin E2表达量较高;与空白组比较,造模后Resolvin D3、Resolvin D5、Resolvin D6、Resolvin E2表达升高,经片仔癀治疗后显著降低或有降低趋势;而与空白组比较,造模后Resolvin E1、Resolvin E3、18S-Resolvin E1、Rsolvin D1表达降低,经片仔癀治疗后Resolvin E1升高。由ELISA结果可知片仔癀对Resolvin Ds具有更显著的调控作用。对受片仔癀调控的Resolvin Ds相关蛋白-通路网络分析,对比IL-1β、TNF-α、IL-6、17(S)-HDHA、19(20)-EpDPE、GSK3A、CD5、KDR 等分子对PZH 的响应值,结果显示,与模型组相比,PZH组KDR和CD5表达上调,GSK3A表达下调;NF-κB通路和PI3K/AKT通路是片仔癀发挥抗炎作用治疗肝移植瘤的两个主要通路。结论:1片仔癀对小鼠肝移植瘤具有明确的治疗作用,对移植瘤的重量和体积具有抑制作用;片仔癀可以抑制血清中炎症细胞因子的表达,进而可能影响肝肿瘤细胞增殖,改善炎症微环境,影响预后。2蛋白组学及其生物信息学分析结果表明,片仔癀治疗小鼠肝移植瘤的作用机制主要包括参与炎症相关蛋白及信号通路的调控,抑制炎症细胞因子的分泌;介导肿瘤细胞G2/M期阻滞,影响肿瘤细胞增殖。3片仔癀可以调控SPMs及其前体脂肪酸代谢,特别是17(S)-HDHA、19(20)-EpDPE、Rsolvin Ds。被调控的SPMs及其前体脂肪酸通过参与KDR、CD5、GSK3A等分子及NF-κB和PI3K/AKT信号通路网络的调控发挥抗炎作用,可能对肿瘤细胞增殖、肿瘤引起的免疫炎症反应有所改善,进而发挥其抗肿瘤作用。