背景在中国,食管癌的发病率和死亡率均列第4位。食管癌具有流行病学特征显著不同的2种组织学类型：鳞癌和腺癌。在中国和其它东亚国家,90%以上的食管癌是鳞状细胞癌,而在美国和欧洲国家,腺癌更常见。食管鳞癌(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)的预后很差,主要是因为大多数患者在晚期才被发现。因此,早期诊断、早期治疗是改善食管鳞癌预后的关键。早期诊断主要依靠健康普查。普查的方法主要包括内镜检查和食管拉网细胞学检查,但其灵敏度、特异性都不理想,甚至还会造成食管损伤。因此,临床上急需高敏感性、高特异性且无创的诊断方法来提高ESCC的诊断能力。肿瘤分子影像学(tumor molecular imaging)的成像基础是肿瘤早期在代谢、细胞分子水平的改变,而非传统影像学比如CT、MRI所显示的疾病发展过程中较晚的形态学变化。对靶分子的特异性成像可以早期、特异地检测肿瘤,具有传统影像手段和方法不具有的优点。这为ESCC的早期诊断带来了新的希望。组织蛋白酶B(cathepsin B, CB)在一些肿瘤中高表达,它和肿瘤的发生发展密切相关,符合分子影像学“靶”选择的一般标准。另外,已有学者选择CB作为成像靶点用于肿瘤诊断的实验研究,并取得令人振奋的结果。因此,在本研究中我们将评估和探讨CB作为一个新的成像靶点用于ESCC活体诊断的可行性,为后续临床研究提供实验数据和理论指导。目的1.通过检测不同食管组织和ESCC细胞中CB的表达,初步判断CB能否作为ESCC及其癌前病变诊断成像的备选靶点。2.应用光学成像技术联合新型CB可激活近红外荧光探针进行荷瘤鼠活体成像,观察CB探针对移植瘤的定位和显像,分析和探讨CB作为一个新的成像靶点用于ESCC活体诊断的可行性。方法1.免疫组织化学法(immunohistochemistry, IHC)检测80例食管组织样本中CB的表达情况,其中包括正常食管、食管上皮内瘤变病变,食管原位癌和浸润癌各20例。2.培养人正常食管上皮HET-1A细胞和人食管鳞癌Eca-109细胞,Western blot检测CB在其中的表达水平。3.回收Eca-109肿瘤细胞培养液,加入不同浓度的CB可激活近红外荧光探针(12.5nM,25nM,50nM,100nM和200nM),新鲜无血清培养液加入等量的CB探针为对照组。观察、分析实验组和对照组不同浓度的CB探针产生的荧光信号的差异,从而判断Eca-109细胞是否分泌CB到胞外。4.CB可激活近红外荧光探针预处理Eca-109肿瘤细胞,免疫细胞化学法(immunocytochemistry, ICC)观察CB的表达和CB探针产生的近红外荧光信号,确认CB探针能够顺利进入Eca-109细胞并且检测发现CB的活性。5.通过皮下种植Eca-109细胞建立人-小鼠ESCC移植瘤模型。当肿瘤直径达到6mm左右时,尾静脉注射CB可激活近红外荧光探针,应用小动物活体成像系统进行荷瘤鼠活体成像。每2h成像1次,连续成像36h。观察、拍照和分析肿瘤部位的荧光信号(n=6)。成像参数：滤光片Cy5.5,激发波长675nm,发射波长680到720nm,曝光时间0.2s,光圈级数2,介质中,视场12.5cm2。荧光强度定义为总辐射效率([p/s]/[μW/cm2]),用相同大小的感兴趣区域(regions of interest, ROI)荧光定量。正常裸鼠作为对照组(n=3)。6.活体成像后,避光取出移植瘤和裸鼠的主要内脏器官,生理盐水冲洗,块儿离体成像。成像参数同上。观察、拍照并分析各个器官包括移植瘤的近红外荧光信号(n=6)。由于各个器官的大小和外形不一,荧光强度定义为平均辐射效率([p/s/cm2/sr]/[μW/cm2]),用不同大小的、不规则形的ROIs定量。这些ROIs和各个器官的外形一致。正常小鼠(n=3)的内脏器官为对照组。7.制作冰冻切片,近红外荧光组织学检查活体和离体成像中移植瘤荧光信号的来源。8.IHC检测BALB/c裸鼠主要内脏器官包括移植瘤中CB的表达情况。结果1.IHC结果显示,人正常食管组织未见CB明显表达,而CB在食管上皮内瘤变病变、原位癌和浸润癌中过表达,且表达量随病变的进展而升高；其阳性率分别为95%(19/20)、95%(19/20)和100%(20/20)。CB主要表达在ESCC细胞浆内,极少量表达在肿瘤间质的巨噬细胞和炎细胞。2. Western blot结果表明,人正常食管上皮HET-1A细胞不表达CB,而人食管鳞癌Eca-109细胞高表达CB。这和IHC的结果一致。3.实验组与对照组相比,不同浓度CB探针的细胞培养液其荧光强度无明显差异,说明Eca-109细胞在体外不分泌CB到胞外。4.细胞免疫荧光结果表明,CB高表达在Eca-109细胞的胞浆中；CB可激活探针产生的近红外荧光信号也局限在胞浆内,且二者的部位完全一致。这说明CB探针分子有一定的通透性,能够顺利进入Eca-109细胞,在CB的降解作用下产生荧光信号。5.荷瘤鼠活体成像结果(n=6)：注射CB探针后立即成像,起初小鼠整个身体只发出微弱的内源性自发荧光(1.34×105±3.3×104),肿瘤局部和身体其他部位的荧光强度无明显差别；2h后,和正常小鼠相比,荷瘤鼠肿瘤部位出现特异的、高亮的近红外荧光信号(9.78×109±2.1×108),并随时间的延长而增强,约32小时到达顶峰(2.90×1010±2.5×109),之后平稳下降。这表明CB探针在体内保持相对稳定,有适当的半衰期,能顺利进入肿瘤细胞,和CB充分反应,在CB的降解作用下产生近红外荧光信号。另外,成像过程中位置表浅的甲状腺和睾丸也表现出相对高的荧光信号,但在各个成像时间点均明显低于肿瘤部位的荧光强度(P<0.05),而且荧光强度变化幅度也较小。对照鼠的左肩胛区域在整个成像过程中没有出现明显的近红外荧光信号(2.04x106±5.3×105),但是它们的甲状腺和睾丸却出现和荷瘤鼠相同部位接近的荧光强度。6.移植瘤和裸鼠主要内脏器官离体成像结果(n=6)：和活体成像结果相似,离体成像中移植瘤的荧光信号也最强(5.81×108±4.3×107)(P<0.05)。在内脏器官中,肝、甲状腺、肾和睾丸依次表现出相对高的荧光信号(3.14×108±3.5x107,2.26×108±4.4×107,2.71×108±3.8×107和1.66×108±2.2×107),食管的荧光信号最弱(1.99×107±2.5×106),而且毗邻它的心脏和肺其信号也很低。移植瘤和各器官的荧光强度比如下：肿瘤/肝1.85,肿瘤/肾2.57,肿瘤/心脏8.4,肿瘤/肺9.57,肿瘤/食管29.20,肿瘤/甲状腺2.14,肿瘤/睾丸5.14,肿瘤/脾15.17,肿瘤/小肠9.217,这清楚地表明CB探针的肿瘤特异性(比值达到2.5一般即可认为探针具有肿瘤特异性)。正常小鼠的内脏器官(对照组)无明显近红外荧光信号。7.近红外荧光组织学显示,肿瘤组织的近红外荧光信号来源于肿瘤细胞的胞浆,这和CB表达的部位一致,说明活体和离体成像中移植瘤的荧光信号来源于Eca-109细胞,而非其它器官或细胞。在移植瘤的边缘肿瘤细胞减少,但近红外荧光信号弥漫性增强,表明肿瘤组织侵袭前缘的CB活性升高。8. BALB/c裸鼠CB阳性表达的器官有肝、肾、甲状腺和睾丸,并且在组织学上CB的表达水平和器官的荧光强度相关,表明CB探针能够反应出体内靶点的数量。这为活体和离体成像中CB探针发现肝、肾、甲状腺和睾丸提供了合理的解释。裸鼠心脏、肺、食管、脾和小肠未见CB明显表达。结论1.主要结论(1)人正常食管组织缺乏CB表达,但在ESCC及其癌前病变中表达明显上调；ESCC细胞Eca-109高表达CB,而正常食管上皮HET-1A细胞不表达CB。因此,CB和ESCC的发生发展相关,可能是ESCC及其癌前病变分子成像的一个备选靶点。(2)应用光学成像技术,联合新型CB可激活近红外荧光探针活体检测人-小鼠ESCC皮下移植瘤是可行的。本研究的结果支持CB作为一个潜在的分子成像靶点用于人食管鳞癌的诊断。2.次要结论(1)ESCC组织中CB主要表达在肿瘤细胞的浆内,极少量表达在间质的巨噬细胞和炎细胞。CB的活性在ESCC移植瘤的边缘明显增高。Eca-109细胞在体外不分泌CB到胞外。(2)新型CB可激活近红外荧光探针Cat B680FASTTM有较强的CB特异性；在体内相对稳定、有适当的半衰期；有一定的通透性,在体内外能够顺利进入Eca-109肿瘤细胞,充分和CB反应,在CB的降解作用下产生近红外荧光信号。(3) BALB/c裸鼠CB阳性表达的器官有肝、肾、甲状腺和睾丸,而心脏、肺、食管、脾和小肠未见CB明显表达。