论文部分内容阅读
目的: NF-κB是普遍存在于细胞浆中的一种转录调节因子,很多疾病与NF-κB信号通路的激活和抑制有关。本课题建立了适合大量微生物代谢产物提取物的筛选和提取方法,采用双荧光素酶报告基因分析方法研究525种代谢产物对NF-κB信号通路的激活和抑制情况,对筛选得到的活性菌株进行发酵罐发酵,对分离得到的化合物进行结构鉴定和生物活性评价,然后进一步做相关基础研究。方法:微生物接种液体培养基中,于180r/min、30℃摇床培养,3d后,加入终浓度70%的乙醇裂解过夜。裂解物离心,取上清,旋转蒸发浓缩并冷冻干燥,获得微生物代谢产物提取物,采用双荧光素酶报告基因分析方法进行筛选,将pNF-ΚB-luc、pRL-TK质粒共转染HEK293细胞,转染后6h加入微生物代谢产物或TNFα(阳性对照),继续培养24h后,检测荧光素酶活性。对3092#活性菌株进行大规模发酵,培养条件为可溶性淀粉1%、葡萄糖2%、牛肉膏0.1%、NaCl0.2%、K2HPO40.025%、酵母提取物1%、CaCO30.2%,PH=7。我们以此条件进行了三批发酵罐发酵,发酵液经过初步提取后得到35.7g粗提物。粗提物采用硅胶柱色谱、凝胶柱色谱、TLC、HPLC等分离方法进行分离,化合物采用HR-MS、13C-NMR、1H-NMR等方法鉴别。对分离到的单体化合物进行双荧光素酶报告基因分析,研究这些化合物对NF-κB信号通路的激活和抑制情况结果:在第一轮筛选中,发现30种代谢物能够激活NF-κB信号通路;28种代谢物能够抑制NF-κB信号通路。在第二轮筛选中,有13种代谢物能够明显激活NF-κB信号通路,没有明显抑制NF-κB信号通路的代谢物。在第三轮筛选和最后验证中,发现6种代谢物均能激活NF-κB信号通路。从粗提物中得到一系列脂肽地衣素类物质(L31-L37),通过与文献比对,确定结构如下:L32:cyclo-[L-Gln1→L-Leu2→D-Leu3→L-Val4→L-Asp5→D-Leu6→L-Ile7]-β-OH fatty acid (isoC13)和cyclo-[L-Gln1→L-Leu2→D-Leu3→L-Val4→L-Asp5→D-Leu6→L-Ile7]-β-OH fatty acid (anteisoC13)L34:cyclo-[L-Gln1→L-Leu2→D-Leu3→L-Val4→L-Asp5→D-Leu6→L-Ile7]-β-OH fatty acid (isoC14)。L36:cyclo-[L-Gln1→L-Leu2→D-Leu3→L-Val4→L-Asp5→D-Leu6→L-Ile7]-β-OH fatty acid (isoC15)和cyclo-[L-Gln1→L-Leu2→D-Leu3→L-Val4→L-Asp5→D-Leu6→L-Ile7]-β-OH fatty acid (anteisoC15)L33:cyclo-[L-Gln1→L-Leu2→D-Leu3→L-Val4→L-Asp5→D-Leu6→L-Ile7]-β-OH fatty acid (isoC13或anteisoC13)和cyclo-[L-Gln1→L-Leu2→D-Leu3→L-Val4→L-Asp5→D-Leu6→L-Val7]-β-OH fatty acid(isoC14或anteisoC14)L35:cyclo-[L-Gln1→L-Leu2→D-Leu3→L-Val4→L-Asp5→D-Leu6→L-Ile7]-β-OH fatty acid (nC14)和cyclo-[L-Gln1→L-Leu2→D-Leu3→L-Val4→L-Asp5→D-Leu6→L-Val7]-β-OH fatty acid (nC15)此外,还分离到5个其他类单体化合物,分离鉴定了其中三个,名称分别为亮氨酸、正十六烷酸、3-羟基癸烷酸。