含2-甲基四氢呋喃介质中脂肪酶催化L-抗坏血酸脂肪酸酯合成的研究

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L-抗坏血酸(维生素C)是最常用的天然抗氧化剂之一,但是由于其极性较强,极大地限制了这种天然抗氧化剂在动植物油脂和化妆品等油溶性产品中的应用。与L-抗坏血酸相比,L-抗坏血酸脂肪酸酯不仅具有更高的脂溶性,而且其抗氧化活性与L-抗坏血酸的抗氧化活性相当,甚至更高,故在食品、化妆品及医药卫生领域具有广泛的应用前景。目前,合成L-抗坏血酸脂肪酸酯的方法主要有化学法和酶法。与化学法相比,酶法具有高效、高区域选择性、工艺简单、反应条件温和等优点,故酶法必将成为未来工业生产L-抗坏血酸脂肪酸酯的主流技术。鉴于L-抗坏血酸极性较强,酶法合成L-抗坏血酸脂肪酸酯通常在极性较强的有机溶剂(丙酮、叔丁醇和叔戊醇等)中进行的,但这类溶剂易剥夺酶表面的必需水而使酶失活,故极大地限制了酶法工艺的应用。生物基溶剂来源于生物质资源,与传统的有机溶剂相比,具有优异的可再生性,可降低对石化资源的依赖,并且具有更好的酶相容性。因此,本论文首先在含新型生物基溶剂2-甲基四氢呋喃(MeTHF)介质中,以十一碳烯酸乙烯酯为活性酰基供体,利用Candida antarctica脂肪酶B(CAL-B)催化合成新的L-抗坏血酸不饱和脂肪酸酯,并系统研究了各因素对该酶反应的影响规律。随后,探讨了CAL-B在MeTHF-叔丁醇混合溶剂中催化L-抗坏血酸与橄榄油等植物油转酯化反应合成其脂肪酸酯的反应特性。在所研究的几种不同来源的固定化脂肪酶中,CAL-B催化L-抗坏血酸区域选择性十一碳烯酰化反应的活性最高。该酶反应的最适反应介质为叔丁醇-MeTHF(1:4),在该混合溶剂中不仅CAL-B具有较高催化活性,而且L-抗坏血酸也具有中等溶解度,故有效地解决了酶催化极性多羟基化合物酰化反应中的一个主要问题—保持较高酶活及一定底物溶解性的溶剂极性截然不同。并且,CAL-B在该混合溶剂中的热稳定性远高于其在常用的叔丁醇、叔戊醇和丙酮中的稳定性。动力学研究表明,在叔丁醇-MeTHF(1:4)中,酶反应的表观活化能较低(26.6vs38.1-39.1kJ/mol),并且固定化酶的催化效率也较高(Vmax/Km,8.4vs1.3-1.4h-1)。该酶反应的最适底物摩尔比(乙烯酯/L-抗坏血酸)、分子筛添加量、酶量及反应温度分别为3、100mg/mL、30U/mL及50oC。当L-抗坏血酸表观浓度为60mM时,在上述最适条件下,反应初速度、最大产率及6-区域选择性分别为41.2mM/h、88.8%及>99%。此外,CAL-B在叔丁醇-MeTHF(1:4)中表现出较高的操作稳定性,重复利用5次后,相对活性仍高于80%。研究表明,CAL-B也是催化橄榄油与L-抗坏血酸转酯化反应合成L-抗坏血酸脂肪酸酯的最适生物催化剂。该反应的主要产物为L-抗坏血酸棕榈酸酯、L-抗坏血酸油酸酯及L-抗坏血酸亚油酸酯,并且其比例与橄榄油中各对应的脂肪酸比例相当。CAL-B催化该反应的最适反应介质、酶量、底物摩尔比(橄榄油/L-抗坏血酸)、L-抗坏血酸浓度及反应温度分别为叔丁醇-MeTHF(3:2)、30U/mL、3、50mM、50oC。在上述条件下,反应初速度和最大转化率分别为7.5mM/h和70.7%。并且反应条件对产物中各组分的含量影响甚微。CAL-B在叔丁醇-MeTHF(3:2)中表现出较高的操作稳定性,重复利用6次,相对酶活仍保持在77%。此外,CAL-B还可以高效催化L-抗坏血酸与其它植物油脂如玉米油、大豆油及菜籽油进行转酯化反应,合成组成各异的L-抗坏血酸脂肪酸酯。本研究不仅有助于丰富对含生物基溶剂体系中生物催化和生物转化的认识,还建立了分别以活性乙烯酯和植物油脂为酰基供体合成L-抗坏血酸脂肪酸酯的酶法新途径。
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