论文部分内容阅读
昆虫已经进化出较高效的先天免疫系统来抵御病原体和寄生虫的入侵。当病原微生物入侵时昆虫会产生免疫防御反应,以应对病原微生物的攻击。柞蚕(Antheraea pernyi)是我国特有的生物资源。在饲养过程中受到多种病原微生物侵染,导致柞蚕患病及死亡。因此研究柞蚕对病原微生物的免疫防御分子机制,对于阐明病原微生物与昆虫的免疫互作机制,挖掘柞蚕抗病种质资源进行品种遗传改良具有重要意义;另一方面,昆虫先天性免疫反应过程需要多种丝氨酸蛋白酶(SPs)的参与从而保证免疫信号的传递及扩大,而丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpins)在此过程中通过调控丝氨酸蛋白酶(SPs)的活性,使得免疫反应迅速剧烈地进行,并且把它限定到一定的程度与范围内,保护宿主自身免受伤害。本研究采用柞蚕核型多角体病毒(ApNPV)感染柞蚕幼虫,建立柞蚕幼虫血淋巴和体壁转录组数据库,研究柞蚕受到病原微生物侵染后基因的表达情况,以揭示柞蚕幼虫血淋巴和体壁对ApNPV的细胞免疫和体液免疫应答,同时,研究了serpins反应活性中心环(RCL)长度系统变化对重组丝氨酸蛋白酶抑制剂(Apserpin-6)抑制活性的影响,结果如下。1.基因表达水平的比较显示,在ApNPV感染的柞蚕幼虫血淋巴中共有3191个差异表达基因(DEGs),其中有1107个上调基因和2084个下调基因。在这些基因中,1416个和982个DEGs分别在3253个GO通路和258条KEGG通路富集。选择参与免疫相关途径的DEGs进一步进行KEGG分析,分别筛选了涉及细胞免疫和体液免疫相关途径的184和63个DEGs。在细胞免疫相关的途径中,自噬、吞噬作用和溶酶体基于几个关键调控基因的表达谱被激活,例如Atg3和LPS诱导TN因子的上调,以及PIK3R4,HSC70和V-ATPase的下调。由于大多数相关DEGs的下调,ApNPV抑制了吞噬体、细胞凋亡和泛素介导的蛋白水解作用。大部分富含Toll、Jak-STAT、MAPK、NF-κB和胰岛素信号通路、补体和凝血级联以及黑色素生成的DEGs均下调,表明ApNPV感染对柞蚕幼虫血淋巴的体液免疫有显著的抑制作用,该结果可作为进一步研究柞蚕抗病毒分子机制的基础。2.杆状病毒侵染可引起昆虫体壁液化,以增强子代病毒体经宿主尸体的传播,从而提高了病毒的传播速率。ApNPV侵染柞蚕幼虫的早期,在感染柞蚕的幼虫体壁角质层中形成圆形脓斑。为了研究这些脓斑的形成机理,运用RNA-Seq分析了ApNPV感染的和未感染的柞蚕幼虫之间的体壁转录组谱变化,使用Trinity平台从头组装转录组。基因表达水平的比较显示,在被ApNPV感染的柞蚕幼虫体壁中共有2990个Unigenes上调和4427个Unigenes下调,其中2620和1903个DEGs可以通过不同的GO注释和KEGG途径富集。在与几丁质代谢相关的DEGs上,筛选到10个与几丁质合成和降解有关的基因具有下调的趋势,表明该几丁质代谢途径被ApNPV感染抑制,这可能促进了柞蚕体壁液化。通过KEGG分析鉴定出大量与免疫相关途径有关的DEGs,表明在柞蚕体壁中发生了强烈的免疫反应,为进一步研究ApNPV感染引起的柞蚕体壁液化的分子机制提供基础。3.本文研究了RCL长度(反应中心N端)的系统变化对重组丝氨酸蛋白酶抑制剂(Apserpin-6)抑制活性的影响,得到了具有RCL缺失或插入残基的4个Apserpin-6的突变体蛋白,并研究了其抑制柞蚕血淋巴中proPO活性的能力。结构域预测结果表明在Apserpin-6 C端的359-379个氨基酸残基之间存在一个反应性中心环(RCL),预测的蛋白质切割位点在374个丝氨酸(P1)和375个丝氨酸(P1’)之间。Apserpin-6 RCL的N末端可变区P7-P1通过定点诱变如碱基的缺失或插入而被截短或延长构建了4个Apserpin-6突变体。通过BamHI/XhoI酶切将具有不同RCL长度的Apserpin-6的cDNA片段克隆到pET28a(+)表达载体中,并将其命名为pET28a(+)-A+、pET28a(+)-AA+、pET28a(+)-F-和pET28a(+)-GF-。将Apserpin-6突变体的重组蛋白添加到A.perny幼虫血淋巴中进行孵育,通过ELISA监测490 nm处的吸光度来检测proPO活性。不同重组蛋白浓度和在血淋巴中的孵育时间下的proPO活性结果表明,RCL的长度影响Apserpin-6的抑制活性,RCL中添加1个或2个残基的重组Apserpin-6对proPO活性没有影响,而RCL中1个或2个残基的缺失降低了抑制Apserpin-6的效率。该研究结果有助于了解RCL对proPO活性的抑制机制。