胆固醇是人体重要的脂质,其稳态及代谢异常与多种疾病相关。胆固醇合成途径中,从羊毛固醇到胆固醇阶段相关跨膜酶的生化及结构生物学研究因为技术难度较大,研究相对较少。其中固醇Δ8,Δ7-异构酶是C8-9双键向C7-8双键异构的关键蛋白质,也是该阶段唯一不需要NADPH参与的酶。该酶在人体的功能缺失会引起CDPX2,MEND等疾病。人源固醇Δ8,Δ7-异构酶由于与钙离子通道抑制剂emopamil结合又叫h EBP（emopamil binding protein）,其与酵母来源的sc ERG2催化同一位置的双键异构,但结构上却不具相关性。人源固醇Δ8,Δ7-异构酶跨膜5次,而酵母源sc ERG2仅跨膜1次。二者虽然分子量只有22～26 k Da,却均具有与多种小分子结合的能力,且多有交叉。本论文以人源和真菌源固醇Δ8,Δ7-异构酶为主要研究对象。由于人源固醇异构酶表达纯化和结晶具有较大的技术困难,本论文对人源固醇Δ8,Δ7-异构酶进行蛋白质热稳定性工程改造以提高蛋白的热稳定性和可结晶性。为此,建立了一种高通量的以热稳定的荧光蛋白TGP为基础的扫描突变筛选方法,对突变体进行热稳定性的评估和筛选。运用该方法进行大量突变的筛选和纯化,包括删除突变,丙氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸系统性扫描突变和融合蛋白构建等,成功的将人源固醇Δ8,Δ7-异构酶的稳定性（表观Tm值）从31.2℃提高至85℃,且稳定性改造后的蛋白质（h EBP-5m1-BRIL）仍具有异构酶活性。对于真菌来源的固醇Δ8,Δ7-异构酶tt EBP（Thermothelomyces thermophilu EBP）,我们以热稳真菌来源的同源序列为基础,对该同源蛋白进行了保守化突变的尝试。通过序列比较,将出现频率高的氨基酸进行组合,构建了con EBP（consensus EBP）,一步突变将稳定性从35.9℃提高至69.9℃,但是其异构酶活性相对于野生型损失了80%。为了在维持热稳定性的同时恢复其活性至野生型水平,进行了快速的嵌合体突变和回复突变,成功回复了异构酶活性,且表观Tm值进一步增高至88.8℃（N4-M5突变体）。上述的扫描突变历时长达两年,而保守化突变仅需要数周时间即获得了比扫描突变提高更多的突变体。因此,相比较而言,保守化突变设计更加省时高效,该方法也为其他膜蛋白的热稳定性改造提供了参考。为了辅助热稳定突变体的筛选,通过同源重组的方法进行酵母基因敲除实验,建立了以ERG2-Fen1-KO酵母菌株为基础的体内功能互补实验体系,和以GC/MS为基础的体外纯化蛋白的功能分析体系及同位素配体结合实验。值得一提的是,人源固醇Δ8,Δ7-异构酶在酵母体内表达时具有异构酶功能,但分离后丧失活性,提示其活性可能需要其它组分（如脂质或其它蛋白质）的参与。另外,本论文还对酵母中的EBP同工酶ERG2进行了表达和纯化,获得了热稳定性较高的蛋白质样品,并开展了结晶条件的筛选。综上,本研究获得了具有异构酶活性的热稳定突变体h EBP-5m1-BRIL、N4-M5和ERG2,为后续的固醇Δ8,Δ7-异构酶与底物/产物的共结晶结构解析提供基础。