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人硒蛋白SelK是哺乳动物体内所含的多种硒蛋白之一,SelK是单跨膜蛋白,前人所作研究已经初步证明其为位于内质网膜和细胞质膜上,但是对其生物功能一直没有阐明。而与SelK基因同源的果蝇硒蛋白dSelK,是果蝇当中功能未知的三种硒蛋白之一。所以本实验的研究可以填补国内外对于这方面研究的空白,得出的一系列试验结果对揭示硒蛋白基因功能具有重要意义。首先,通过将本实验室已构建成功的人硒蛋白SelK在人体细胞中的融合蛋白表达载体pGFP-SelK-secis-C1中SelK-secis的cDNA片段,插入到表达载体pE-Dsred2-C1中,构建了人硒蛋白SelK-secis与红色荧光蛋白DsRed的人体细胞融合表达质粒pDsred2-SelK-secis-Cl,并通过酶切和测序验证其正确性。然后,通过脂质体转染的方法,将pDsred2-SelK-secis-C1质粒转染人胃癌BGC-823细胞中,利用流式细胞仪检测SelK在人胃癌细胞中过表达诱导人胃癌细胞凋亡的情况。研究发现,人体硒蛋白SelK在人胃癌细胞中的过表达能够引起胃癌细胞的凋亡,与对照组(空质粒组)比较差异显著(p<0.05)。随后利用Fluo-3 AM进行对细胞浆中的游离钙离子染色,并通过激光共聚焦显微镜及钙离子荧光强度分析软件比较其转染后细胞浆中游离钙离子浓度的变化。结果显示人硒蛋白SelK-secis和SelK在人胃癌BGC-823细胞中过表达时细胞浆中钙离子浓度分别升高了 1.055倍和0.7421倍,与对照组(转染正常人胚肾HKE293细胞组)比较差异极显著(P<0.01)。接下来通过透射电子显微镜对融合蛋白表达质粒pE-dSelK-Dsred2-N1转染的人胃癌细胞的细胞生长状态进行了研究。研究表明,细胞核内染色质凝集,染色质凝缩于核膜下,细胞出现众多小泡等凋亡早期,中期和晚期的典型特征。另外,用流式细胞仪检测人体硒蛋白在果蝇中的同源基因dSelK在人胃癌细胞中过表达后诱导凋亡的情况和钙浓度变化情况。研究发现,果蝇硒蛋白dSelK在人胃癌细胞中的过表达同样诱导癌细胞凋亡并引起细胞浆中游离钙离子含量的升高,并与各自的对照组比较差异显著(p<0.05)。说明果蝇硒蛋白dSelK能够引起人体癌细胞株的凋亡。综上所述,本实验通过对人硒蛋白SelK-secis和其在果蝇中同源基因dSelK在BGC-823细胞中过表达时细胞浆内钙离子浓度变化的测定及对人胃癌BGC-823细胞生长状态的观察,发现人硒蛋白SelK-secis和其同源基因dSelK能够通过控制内质网内钙离子向细胞质中的释放,进而引起细胞发生细胞凋亡等细胞生长状态的变化。在国内外首次阐明了人硒蛋白SelK-secis和果蝇硒蛋白dSelK的生物功能,上述研究对于揭示生物体中其它硒蛋白的生物功能具有重要的指导意义。