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为了获得高纯度、高比活的纳豆激酶产品。我们以生产纳豆激酶的Bacillus subtilis进行深层发酵得到的发酵液为原料,离心去除菌体,进行分离纯化。采用两种方法,第一种方法:20%-60%饱和度硫酸铵沉淀,Superdex 75凝胶过滤层析和SP SepharoseFast Flow离子交换层析对活性组分进行分离提纯,用纤维平版法测定活力,SDS-PAGE对分离纯化的效果进行了检验,只观察到单一条带,最终纯化倍数和酶活回收率分别为8. 4和49%。第二种方法:将发酵液装入截留分子量为6,000的透析袋中,置于纯水中透析24小时。透析后的酶活回收率为83. 8%,纯化倍数为1. 05。将透析后的发酵液上SP Sepharose Fast Flow离子交换柱进行梯度洗脱,流速为5mL/min,上样量为15mL,最终的纯化倍数为2. 4,酶活回收率为71%。所得到的纳豆激酶有杂蛋白。考察纯品纳豆激酶的酶学性质得到以下结果,纳豆激酶作用于纤维蛋白的最适温度为55℃左右,最适pH为9. 4左右。纳豆激酶在pH6-12的范围内稳定。纳豆激酶在37℃以下,5小时失活并不明显,45℃下略有失活,而当温度达到50℃后酶活下降很快。NK酶液在4℃下放置一周酶活仅仅损失16%,室温下放置一周酶活损失37%,37℃下放置18hr酶活仍保有85%,放置2天仍在50%以上。0. 1mM PMSF可以完全抑制纳豆激酶活力,EDTA不抑制纳豆激酶活力,DTT对纳豆激酶的活性没有影响,1mM低浓度的SDS不抑制纳豆激酶活性,10mM SDS略有抑制作用。Mg2+对纳豆激酶有微弱的激活作用;Ca2+、Ba2+的影响不大;其它一些金属离子存在不同程度的抑制作用,Cu2+的抑制作用最明显,Al3+、K+、Fe2+、Fe3+、Zn2+、Mn2+、Co2+、Ni2+、Cr3+、Pb2+、Ag+也有不同程度的抑制作用。脱脂乳粉、明胶、海藻酸钠、壳聚糖、BSA、淀粉、甘油、糊精、甘露醇都有在高温环境下稳定NK的作用。纳豆激酶的溶栓方式不同于尿激酶,既有直接作用方式,又有间接作用方式,直接纤溶活性占总活性的78%左右。纳豆激酶降解纤维蛋白不同肽链的速度不等,γ-γ二聚体的降解速度快于α链,而α链又要快于β链和γ链。为了使纳豆激酶在肠道中得到吸收,本文对纳豆激酶的肠溶药物进行了初步研究,分别以海藻酸钙和CAP(邻苯二甲酸醋酸纤维素酯)为包衣材料,得到以下结果:海藻酸钙纳豆激酶肠溶胶囊在模拟胃液中,2h内的释放度为8. 1%。在模拟肠液中,2h后的释放量为82. 6%。但前1h内的释放量只有14. 8%,回收率为75. 8%。以CAP为原料制备的肠溶微丸,在模拟胃液中2h内总释放度不到10%,在模拟肠液中,在60min内完全溶解,回收率为26. 3%。为了提高酶活回收率,加入不同的辅料,脱脂乳粉的效果最明显,加入后酶活回收率提高到63. 4%。其次是明胶,除了淀粉以外,海藻酸钠、甘油、糊精、甘露醇、壳聚糖、BSA都能起到一定的稳定作用。