肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一,发病率一直呈上升趋势,早期诊断对肝癌的防治是十分重要的。磷脂酰肌醇蛋白聚糖3基因(GPC3)是新近发现的具有肝癌组织特异性的高表达基因,其在正常肝组织及良性肝脏病变中不表达,而在肝癌中高表达,可能是一种潜在的敏感性好、特异性高的新型肝细胞癌的标志物。GPC3的生物学功能还不是很清楚,需要进行深入研究。肝癌细胞具有容易侵犯血管的特性,极易造成癌细胞的血行播散,这可能是导致肝癌切除术后及肝移植术后肿瘤复发、转移率高、预后较差的重要原因,因此对肝癌病人外周血进行循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cell, CTC)检测,对于判断肝癌的病理分期、治疗效果及预后都具有重要的意义。本研究制备了针对GPC3的单抗和多抗,为建立灵敏的肝细胞癌早期诊断方法及深入研究GPC3的生物学功能提供了技术手段;建立了肝癌CTC检测方法并评价了CTC检测在肝癌病人临床诊断中的应用价值。1.抗-GPC3抗体的制备及鉴定①.抗-GPC3多抗的制备及鉴定:本研究采用基因工程技术重组表达GPC3-N端蛋白。从人肝癌细胞株HepG2中提取总RNA,反转录合成cDNA后用RT-PCR扩增出GPC3-N端基因;利用基因重组技术,将这部分GPC3-N端基因片段(编码32-249aa )亚克隆至pQE30原核表达载体,表达并纯化GPC3-N末端蛋白;用纯化的蛋白GPC3-N免疫大耳白兔制备针对GPC3的特异性抗体。ELISA检测结果显示,用重组蛋白GPC3-N免疫大耳白兔制备的兔源多克隆抗体效价高,其滴度达到1:20万以上;采用硫酸铵沉淀法纯化了兔多抗血清,用Western blot及细胞免疫荧光技术对纯化后的兔多抗进行免疫学鉴定。实验结果表明,制备的多克隆抗体是针对GPC3-N重组蛋白的高效价抗体。应用生物分析软件预测分析GPC3蛋白优势抗原表位,根据分析结果合成2个多肽(LW1和LW2),免疫大耳白兔制备相应的多克隆抗体。ELISA检测显示,LW1制备的兔源多克隆抗体有较高效价,其滴度可达到1:20万以上;采用硫酸铵沉淀法纯化兔多抗血清,用细胞免疫荧光技术对纯化后的兔多抗进行免疫学鉴定,结果显示LW1多克隆抗体能特异识别GPC3蛋白。②.抗- GPC3单克隆抗体的制备与鉴定:以合成的LW1及LW2多肽免疫BALB/c小鼠,第三次加强免疫后,检测小鼠血清抗体效价,抗体滴度达到1:20万以上。选择效价最高的免疫小鼠进行细胞融合制备单克隆抗体。经筛选和鉴定,成功获得了10株高效价单抗细胞株。用Western blot法,以纯化的单克隆抗体为一抗,检测肝癌细胞系HepG2、Huh7、人正常肝细胞L02中GPC3-N的表达,对抗体的特异性进行鉴定。结果显示LW1抗单克隆抗体能特异识别我们制备的重组蛋白GPC3-N和肝癌细胞上表达的GPC3蛋白。采用细胞免疫荧光技术检测肝癌细胞系HepG2,宫颈癌细胞细胞系Hela和正常肝细胞系L02中GPC3的表达情况,结果显示GPC3蛋白定位于癌细胞胞膜及胞浆,只在肝癌细胞系里有特异表达,在人正常细胞及宫颈癌细胞中不表达。将制备的抗-GPC3单抗应用于肝癌患者循环肿瘤细胞的检测中,结果显示抗-GPC3单抗能特异识别肝癌病人外周循环血液中的肝癌细胞。实验结果表明,本研究获得的抗-GPC3单抗具有良好的特异性,为深入研究GPC3蛋白的生物学功能及其在诊断中的应用奠定了基础。2.肝癌病人外周血循环肿瘤细胞检测方法研究外周血循环肿瘤细胞(CTC)指自发或因诊疗操作从原发肿瘤脱落下来从而进入外周血循环的肿瘤细胞。CTC检测在肿瘤的分期、转移、复发的早期预测等方面具有重要的意义。本研究采用免疫磁珠分离技术,去除肝癌患者外周血中的绝大多数白细胞,从而将血中剩余的稀有细胞包括肿瘤细胞进行富集,再利用免疫荧光技术对肿瘤细胞进行鉴别诊断。通过肝癌细胞回收实验验证了CTC富集方法的有效性。实验结果显示,对血液标本中不同个数的肝癌细胞的回收率达到99%。说明该富集方法能有效的去除血液中的白细胞,准确而稳定的回收血液标本中的肝癌细胞。采用该技术方法对53例原发肝癌患者外周血液标本进行CTC检测。实验结果表明,30例早期肝癌病人外周血液样本中的CTC的检出率为26.7%;在17例中晚期肝癌未化疗患者血液中CTC的检出率为94.12%;在中晚期肝癌化疗后患者中,CTC的检出率为16.67%。由此可知,在中晚期肝癌未化疗患者中CTC检测的检出率最高。在8例早期肝癌患者肝移植手术前采血样本CTC检测为阳性,可能提示这8例患者术后复发的几率增大。在6例中晚期肝癌病人化疗后采集的血液样本中,只有1例CTC检测阳性,且很低CTC数目为1,其它5例CTC为阴性的病人,均为化疗后一周内采集的标本。实验表明, CTC数量的改变可以反映肿瘤对化疗药物的敏感性,建立的肝癌CTC检测方法可以有效的反应患者的临床治疗效果情况。上述研究表明,肝癌病人外周CTC检测对于肝癌的诊断、治疗效果评价和愈后转归、复发预测具有重要的意义。