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第一部分Aurora A激酶在小鼠胰腺组织中的表达分布研究研究背景及目的:研究Aurora A激酶在成年小鼠正常胰腺组织内和胰腺炎期间小鼠胰腺组织中的表达水平规律,并进一步探索胰腺组织中的Aurora A表达水平是否受炎症调控的表达情况。研究方法:首先我们对青年BAC小鼠进行腹腔注射超剂量雨蛙素刺激诱导急性胰腺炎,每天8次,注射一天后,分别在不同的时间节点(day 1-7)收集相应的急性胰腺炎动物模型的胰腺组织,并与无雨蛙素刺激组(day 0)为对照。通过q RT-PCR、Western Blot和免疫组织化学染色方法检测不同处理的正常青年BAC小鼠的胰腺组织的Aurora A表达情况,并比较正常小鼠无处理胰腺组织和处于急性胰腺炎不同阶段的胰腺组织中的Aurora A表达水平差异。研究结果:q RT-PCR结果显示正常青年BAC小鼠胰腺组织中Aurora A基因的基础表达量较低,随着雨蛙素诱导胰腺组织内急性炎症的发生发展,Aurora A在胰腺组织内的表达量逐渐上升,并在雨蛙素诱导急性胰腺炎后的第4-5天达到峰值,约为正常无处理组的25倍,达到此峰值后Aurora A的表达量在几天内显著降低。Western blot和石蜡切片免疫组织化学染色的结果与q RT-PCR结果相似,均证实了Aurora A蛋白的表达量在处于急性炎症期间的胰腺组织内较之无处理组正常小鼠胰腺组织内显著高表达,其表达水平在雨蛙素构建的急性胰腺炎一周内呈现一个双相曲线的状态,Aurora A蛋白的表达水平在第3-5天达到峰值,显著高于雨蛙素诱导胰腺炎后的第1-3天、6-7天的胰腺组织内的表达量。结论:Aurora A激酶在小鼠正常胰腺组织和急性炎症期间的胰腺组织内均有表达,且雨蛙素构建的急性胰腺炎症动物模型的胰腺组织内Aurora A的表达水平有着明显的时效性。胰腺急性炎症期间的胰腺组织内的Aurora A的表达水平会随着时间的推移产生较为明显的双向性改变,并显著高于正常胰腺组织内的表达。第二部分胰腺腺泡细胞Aurora A激酶特异性敲除转基因动物的培育及其表型研究背景及目的:利用外源性他莫西芬诱导型Cre-Loxp重组系统构建胰腺腺泡细胞内的Aurora A激酶条件性敲除小鼠(AUO/BAC)。我们通过这种方法构建和培育了纯合AUO/BAC工具鼠,并观察了它的表型。研究方法:我们使用带有胰腺腺泡-弹力蛋白酶I特异性的启动子调控的Cre ERT工具鼠(BAC),与带有floxed Aurora A片段的AUO纯合工具鼠(AURKAflox/flox)进行交叉培育,在他莫西芬外源性诱导的条件下,预期得到纯合的胰腺腺泡细胞内Aurora A基因条件性敲除AUO/BAC工具鼠(Ela-Cre ERT;AURKAf/f)。他莫西芬诱导重组后,我们通过q RT-PCR验证了Aurora A在AUO/BAC工具鼠胰腺组织内的相对低表达。我们还通过计算和比较目的基因敲除工具鼠和对照组BAC工具鼠的全胰腺重量占总体重比例百分比,并通过对两种不同小鼠的正常无处理胰腺组织的组织病理学以及免疫荧光核染图片的比较,初步明确了Aurora A在胰腺腺泡细胞内敲除后的胰腺组织病理学相关表型的改变。研究结果:首先是我们成功构建了纯合的AUO/BAC工具鼠。因如上部分所述,Aurora A激酶在成年BAC小鼠胰腺组织内的基础表达量较低,我们通过对比两组小鼠在雨蛙素构建急性胰腺炎动物模型3天后收集的胰腺组织内的Aurora A基因的相对表达量水平发现,AUO/BAC小鼠胰腺组织内的Aurora A表达量相比BAC小鼠胰腺组织内的表达水平显著降低。而H&E和免疫荧光DAPI染色的结果提示AUO/BAC工具鼠的正常胰腺组织与正常小鼠胰腺相比无明显差异,但AUO/BAC小鼠较之对照组BAC小鼠的胰腺腺泡内的胞核增大、积聚,多倍体细胞数量明显增多。结论:Aurora A激酶在小鼠胰腺腺泡细胞内的特异性条件性敲除可在胰腺腺泡细胞的组织病理学上产生有辨识度的改变,但对小鼠胰腺本身的发育功能和小鼠存活无明显影响。第三部分胰腺腺泡细胞Aurora A激酶特异性敲除对胰腺炎的作用影响研究背景及目的:本部分实验中,为了明确胰腺腺泡细胞内Aurora A基因敲除是否会对急、慢性胰腺炎造成影响。我们对实验组AUO/BAC和对照组BAC小鼠同期进行腹腔注射大剂量雨蛙素急性和慢性胰腺炎造模,并检测和比较不同基因型小鼠胰腺组织的急性和慢性损伤程度以及损伤的恢复情况。研究方法:首先培育小鼠,将前两部分中得到并验证过基因型的小鼠按年龄、性别等匹配分组。他莫西芬灌胃诱导基因条件性敲除后休息几天,对实验组和对照组小鼠予以同等剂量的雨蛙素刺激。雨蛙素注射剂量为100ug/kg/b.wt./次,急性胰腺炎组动物予以腹腔注射雨蛙素,注射间隔时间为一小时一次,共10次/天,于首次注射雨蛙素24小时后处死小鼠,记录湿/干体重比,收取血清标本测量淀粉酶释放水平,观察急性胰腺炎损伤程度,q RT-PCR检测细胞因子IL-1b,IL-6,CXCL-10的表达水平,采用CD11b特特异性染色检测炎症细胞浸润水平,Ki-67特异性色检测细胞增殖水平,Caspase-3特异性染色观察细胞凋亡水平;慢性胰腺炎组动物予同样予以雨蛙素刺激,6次/天,每周3次,重复三周后停止给药,于首次注射雨蛙素4周后处死小鼠,记录湿重/干重比重,取胰腺组织观察胰腺病变损伤和恢复程度,CD11b和F4/80免疫组织化学染色检测炎性细胞浸润情况,Sirius-Red特殊染色检测胶原纤维沉积,并注意对比实验组和对照组小鼠间的区别。研究结果:他莫西芬诱导后,我们在2种基因型小鼠身上成功构建了雨蛙素诱导型急性胰腺炎动物模型,HE染色结果显示AUO/BAC-AP组小鼠的胰腺组织中存在更多的腺泡细胞坏死和炎性细胞渗出,炎性细胞因子IL-1b,IL-6,CXCL-10表达量在AUO/BAC-AP组小鼠中较BAC组小鼠显著升高,CD11b和Caspase-3染色阳性细胞在AUO/BAC-AP小鼠组中明显较多,而Ki-67表达量显著低于BAC-AP小鼠组,另外两组间的血清淀粉酶水平和胰腺重量/总体重比并无明显差别。基于以上结果,我们进一步在2种基因型小鼠身上成功构建了雨蛙素诱导型慢性胰腺炎动物模型,H&E染色和Sirius-Red染色结果显示AUO/BAC-CP组小鼠胰腺组织存在更多腺泡细胞萎缩和坏死,胰腺纤维化,脂肪替代等慢性胰腺炎改变。而体重比显示胰体萎缩程度显著高于BAC-CP组小鼠,CD11b及F4/80免疫组织化学阳性细胞染色在AUO/BAC-CP组中的表达量也显著高于BAC-CP组小鼠。结论:综上实验所述,我们通过动物体内实验明确了胰腺腺泡细胞内Aurora A激酶海军军医大学博士学位论文条件性敲除可显著提高小鼠对雨蛙素诱导下胰腺组织的炎性反应,包括在早期加重炎性细胞浸润和细胞坏死等,这说明Aurora A激酶可在炎症早期保护腺泡细胞死亡,并在远期继续影响胰腺组织的恢复和纤维化改变等。通过以上结果最终明确Aurora A或对胰腺炎症中的腺泡细胞存活和细胞再生起到保护作用,敲除后可在雨蛙素动物模型中加重急慢性胰腺炎症反应。