呼吸道病毒是引起呼吸道感染的主要病原,其变异频繁。突变可增加病毒传播力、致病性,产生耐药,形成新的型别,是导致新发突发传染病的重要病原。因此,在呼吸道传染病防控中,检测并鉴定其基因组序列信息,是明确基因变异特征,评估病毒潜在流行传播特征和致病性的关键。下一代测序技术突破了传统的分离培养和基于已知序列设计引物鉴定病原的局限性,已广泛用于各种样本中病原基因组序列的获取。但高丰度的宿主基因组使得深度测序从临床样本中中获取病毒基因组序列受到很大干扰,近年发展了多种富集技术,以提高深度测序对临床样本中病毒基因组的获取,其中基于二代测序的的靶向捕获富集探针体系被认为是开启了分子检测的新时代。目前有两篇报道提出病毒捕获体系设计策略,在测序灵敏度和基因组覆盖度上均具有较好结果。由于其针对所有脊椎动物病毒,受限于当前商品化合成探针最高为200兆库容限制,探针设计仅用各物种中的一条或几条基因组序列作为参考,不足以鉴定基因多态性。因此,针对不同感染症候群病毒病原设计针对性的富集捕获体系成为趋势。呼吸道病毒由于其序列多态性强,如何优化探针的设计,采用何种探针合成策略,如何优化建库条件是建立这一富集体系需要解决的技术难点。因此,本研究针对可导致人呼吸道感染的常见呼吸道病毒,通过解决上述技术难点,设计建立基于下一代高通量深度测序技术的液相靶向富集捕获探针集及相关技术体系,为相关传染病防控提供技术体系支撑。通过对公共数据库中发布的鼻病毒、肠道病毒、冠状病毒、流感病毒、副流感病毒、偏肺病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒以及博卡病毒共21个种属呼吸道病毒序列的收集整理,用120-mer策略片段化序列。遵循序列对该物种基因组序列的覆盖度不低于90%原则对保守序列去冗余,经过序列相似度60%、70%、80%、90%和99%去冗余阈值测试,以95%或99%为去冗余阈值,按照连续15个碱基与病毒序列互补和探针序列与参比序列相似度>75%为标准质控,合成库容为8.35M的RNA探针库。用细胞株和临床样本中获得的腺病毒、甲型流感病毒(H3N2)、乙型流感、人冠状病毒OC43fNL63fHKU1/229E、人偏肺病毒、人副流感2型病毒、肠道病毒以及鼻病毒核酸,按照拷贝数稀释为107/ul、105/ul和104/ul分析捕获效率。结果表明,核酸拷贝数为107、105和104时,靶向富集后全基因组平均覆盖度比未经富集捕获的核酸序列覆盖度分别增加2.7倍、1.17倍和3.12倍;基因组覆盖深度分别提高5.10-256倍、2.69-257.55倍和1.00-428.86倍。对基因组覆盖深度增加,获得单碱基多样性数量是未经捕获的3.1-15.9倍。对临床样本的分析表明,在实时定量鉴定仅有1个拷贝的2009甲型H1N1病毒的肺泡灌洗液样本,用常规宏基因组无偏移扩增富集体系仅发现PB2节段的3条reads。而靶向捕获富集能获得4个基因节段序列433reads信息,表明捕获体系在确认病毒感染上更灵敏;在有1个拷贝腺病毒的灌洗液中,与常规方法比较,靶向富集后获得的序列基因组覆盖度增加了近五倍,测序深度由5.37×提高至18.73×。本研究建立的基于高通量深度测序技术的人呼吸道病毒富集捕获技术体系,提高了临床样本中低丰度病毒核酸的检出,在基因组和多态性覆盖度上优于现有无偏移扩增技术,有助于获取更全面的病毒全基因组序列信息。该体系适用于样本中极低丰度的常见呼吸道病毒基因序列的捕获,发现临床病例样本中更多的病毒基因突变,有助于阐释包括耐药、毒力变化功能位点和发现准种,为呼吸道传染病的防控和病原学研究提供了实用研究技术储备。