背景在我国,糖尿病肾病(DN)的发病率和患病率呈现出一个明显上升的趋势,是导致终末期肾脏病(ESRD)的第二位病因,给人民的健康带来了严重的威胁。但是,目前对于DN的治疗并没有很好的办法,DN仍然具有很高的致死率和致残率。因此,如何更好地了解DN的发病机制及其病理生理变化,从而更好地防治DN,就成为了一个亟待解决的问题。目前已有不少的研究提示,血管内皮生长因子(VEGF)及其2型受体Flk-1 (VEGF-Flk-1)系统在DN的发病过程中具有重要的作用。在动物实验中,使用拮抗VEGF-Flk-1系统的药物也能够很好地缓解DN的病变。因此,拮抗VEGF-Flk-1系统有可能为DN的治疗带来新的手段和更好的疗效。但是,另一方面,目前的拮抗VEGF-Flk-1系统药物还存在一些比较严重的副作用,很难用于临床实践之中。因此,如何研究和开发副作用较小的抗VEGF-Flk-1系统药物,从而更好地防治DN就显得尤其的重要。白藜芦醇作为一种天然的植物提取物,其副作用很小,已广泛地用于人类的生活保健之中。而新近有研究提示,它也有很好的拮抗VEGF的作用,从而应用于肿瘤的研究之中。而另一方面,已有不少研究表明,白藜芦醇能够通过激活沉默信息调节子1 (SIRT1),对糖尿病及其并发症具有多方面的保护作用。而近来有研究亦提示,SIRT1本身也具有很强的抑制VEGF表达的作用。因此,本课题旨在研究白藜芦醇是否能够通过激活SIRT1,抑制VEGF-Flk-1系统,而缓解DN的病变,从而为DN的防治提供一个更好的手段。方法(一)动物实验：对SD大鼠予以单肾切除后,使用链唑霉素造成1型糖尿病肾病的大鼠模型,随机分成对照组、糖尿病肾病组、以及糖尿病肾病加白藜芦醇治疗组,8周后收集尿及肾脏标本。(1)检测各组大鼠的体重、血糖、尿白蛋白排泄率、肌酐清除率、肾重的水平；用过碘酸-雪夫氏染色的方法检测各组大鼠肾小球的大小、肾小球内基质的沉积水平和用透射电镜检测其肾小球基底膜的厚度；以及使用免疫组织化学术和Western blot等方法检测其肾脏纤维化水平,包括Ⅳ型胶原、纤连蛋白、转化生长因子-β1、结缔组织生长因子、纤溶酶原激活物抑制剂-1等的表达水平。(2)用免疫组织化学术检测大鼠肾脏中SIRT1的表达位置,用Western blot检测各组大鼠肾脏内VEGF和Flk-1,以及Tie-2和血管生成素-1 (Ang-1)的表达水平,用Real time PCR检测各组大鼠肾脏内血管生成素-2(Ang-2)的mRNA转录水平。(二)体外实验：(1)体外培养小鼠肾小球足细胞,分别给予正常糖、高糖、以及高糖加白藜芦醇干预,而后使用Western blot. Realtime PCR和ELISA的方法,检测各组细胞内VEGF表达和分泌的变化；并且通过以慢病毒为载体的RNA干扰进一步研究SIRT1在其中所起的潜在介导作用。(2)体外培养小鼠肾小球内皮细胞,分别给予正常糖、高糖、以及高糖加白藜芦醇干预,而后使用Western blot、Realtime PCR的方法,检测各组细胞内Flk-1表达的变化；并且通过以慢病毒为载体的RNA干扰以及转染过表达质粒的方法,进一步研究SIRT1在其中所起的潜在介导作用。(3)体外培养小鼠肾小球内皮细胞,分成正常对照组、VEGF刺激组和VEGF加白藜芦醇干预组,使用免疫荧光的方法,观察各组内皮细胞间细胞连接的变化；并且通过使用一种体外血管通透性试剂盒,进一步检测各组细胞通透性的变化。结果(一)动物实验：(1)糖尿病肾病组和白藜芦醇治疗组大鼠的体重和血糖水平无显著性差异,但较正常组分别有明显的下降和升高；与正常组大鼠相比,糖尿病肾病大鼠的尿白蛋白排泄率、肌酐清除率、肾重的水平均显著地增加,而白藜芦醇治疗组则较糖尿病肾病组有明显的下降；糖尿病肾病组大鼠的肾小球直径、肾小球系膜基质沉积水平、以及肾小球基底膜的厚度均较正常组显著地增加,而白藜芦醇治疗组则较糖尿病肾病组有明显的下降；在肾脏纤维化方面,糖尿病肾病组大鼠肾脏内Ⅳ型胶原、纤连蛋白、转化生长因子-β1、结缔组织生长因子、纤溶酶原激活物抑制剂-1等的表达水平均较正常组显著的增加,而白藜芦醇治疗组则较糖尿病肾病组有明显的下降。(2)在大鼠的肾小球内,SIRT1在足细胞、系膜细胞以及内皮细胞核中均有较明显的表达；VEGF和Flk-1的表达水平在糖尿病肾病组的大鼠肾脏内均明显的升高,而在白藜芦醇治疗组其肾脏内的表达水平较糖尿病肾病组有显著的下降；Tie-2的表达水平在糖尿病肾病组中则明显的下降,治疗组则有所回升,而Ang-1的表达水平在各组间均无明显的差异。Ang-2的mRNA转录水平在糖尿病肾病组中明显升高,而使用白藜芦醇治疗组其Ang-2的转录较糖尿病肾病组减少。(二)体外实验：(1)在培养的肾小球足细胞中,白藜芦醇能够显著地抑制由高糖刺激引起的足细胞内VEGF表达和分泌的升高,并且呈明显的剂量和时间依赖性；而下调足细胞内SIRT1的表达后,白藜芦醇的这种对VEGF表达的抑制作用明显减弱。(2)在培养的肾小球内皮细胞中,白藜芦醇能够显著地抑制由高糖刺激引起的内皮细胞内Flk-1表达的增加,并且呈明显的剂量和时间依赖性；而下调内皮细胞内SIRT1的表达后,白藜芦醇的这种对Flk-1表达的抑制作用明显减弱；上调其细胞内SIRT1的表达则能够明显地抑制Flk-1的表达。(3)在培养的肾小球内皮细胞中,白藜芦醇能够明显地保护由VEGF刺激引起的内皮细胞连接的破坏；并且能够显著地降低由于VEGF刺激引起的内皮细胞通透性的增加。结论白藜芦醇能够通过激活SIRT1,抑制VEGF-Flk-1系统,从而缓解糖尿病肾病