背景：尽管EB病毒在鼻咽癌中明确的致癌机制仍未被探明，但是二者之间密切的关系早已被众多的研究所证实。原位杂交实验研究表明，在几乎所有鼻咽癌组织中都存在EBVDNA。新近研究不仅证明完整EB病毒能诱发人鼻咽粘膜上皮发生癌变，并在细胞呈恶性转变后的早期起到促进癌细胞增殖的作用。目前对EB病毒感染的诊断，一般是基于血清学证据，而血清学只是感染的间接标志，当机体免疫力低下时，则很难获得可供诊断的血清学结果，并且由于人群感染或携带EBV的普遍性，血清学检测对现症感染的诊断价值受到一定限制。病理检查和原位杂交实验可以提供直接对病变细胞的微观检测，但是针对鼻咽癌特定部位取活组织作标本不但会给患者带来一定的痛苦而且较费时。一般情况下，形态正常的鼻咽上皮细胞内极少检出EBV存在，一旦发生了异常分化就会有EBVDNA被检出，新近研究证实，鼻咽上皮细胞中EBVDNA存在的量与细胞分化程度密切相关。因此，建立直接、特异的针对EB病毒病原的检测方法将可能成为在高危人群中筛查鼻咽癌的有效手段。 本实验以鼻咽部脱落的上皮细胞为研究对象，对其内的DNA进行EB病毒FQ-PCR(Fluorescence quantitative PCR)定量检测，设立细胞内参照，利用荧光双标记的探针对扩增的目的基因进行即时杂交，测定其荧光强度并与细胞内参照的荧光强度进行比较，从而达到对目的基因进行量化分析的目的，所得数据说明单位细胞的带毒量，反映病毒在局部复制的活跃程度，其活跃程度与病程病期密切相关，因而可用于NPC病人的筛查，并可能应用于该病的风险评估和放疗的疗效观察。 目的：建立荧光定量PCR检测人鼻咽部脱落细胞中EBV-DNA的方法。 南京区科大学硕士学位论文 方法： 1．标本采集 整个操作过程由耳鼻喉科大夫在无菌条件下进行。 2．核酸提取 送检的标本在4℃条件下，6O00转／分离心20分钟 后，弃上清，沉淀用无菌生理盐水洗涤离心后转AEppendof管。 采用蛋白酶K消化，苯酚和氯仿抽提，酒精沉淀法提取细胞DNA。 用30只1n缓冲液溶解提取的mA，置入刁口℃冰箱中冷藏备用。 3．引物及探针 目的基因片段，选用如下引物序列：上游引物5’七A GAA GGC CAT TTT TCC AC－3’和下游引物5’－TTT CTA CGT GAC TCC TAG ＊－3’，扩增片段长262＊，探针序列：5’－＊C＊CGG＊C＊G ATGG－3＼细胞内参照 0－globin（0－球蛋白）基困片段卜’，选用引物： GH20：5’－GAA GAG CCA AGG ACA GGT AC—3’和 PC04：5’－CAA CTT CAT “A“TnAC＊3’，扩增片段长度260＊，探针序列：5’－＊T叮G＊C AAC CTC AAAC—3’。 4．h化荧光定量盯R反应体系 固定复性温度为5 5 C，同时固定模 板量使每管的模板量相同，将镁离子浓度和Buffer浓度进行两因 素三水平的析因设计。将复性温度改为45C，重复实验。选择最佳 反应条件。 5．对优化反应体系的稳定性实验 采用经杂交证实EBV阳性的标本 作为模板，进行五次EBNAI和卜globin基因两片段两管同时F小PCR 扩增，以观察最佳反应体系的稳定性。 6．将以上优化的反应体系应用于临床标本 取临床标本29份，分两 管分别扩增目的基因EBNAI和细胞内参照p飞lobin基因片段。 结果： 1．析困实验反应的结果选取 2。Buffer，3．口。of／l镁离子浓度， 复性温度固定为 5 5 C，为最佳反应体系。 2．以上优化的反应体系应用于 EBNAI阳性质粒，可以得到满意的荧 光曲线；采用两份标本O和B）进行稳定性及重复性实验（每次设 立阳性对照、阴性对照及空白对照），结果稳定，u标本的以E儿t 2 南京区科大学硕士学位论丈 6为 1．0＊．02，n吕5，CV＝0．02；B为 0．98．03，n＝5，CVS0．03）。 3．临床标掀测：临床标本29份，p－globin片段均为阳性，EBNAI 阳性22份，临床资料给出EBNAI阳性者全部为鼻咽癌。 结论 通过我们的实验证实，Fg平CR反应体系中，荧光标记的探针与，模板成功杂交并发出荧光需要一定的Buffer浓度即离子强度。本 方法的稳定性良好，对临床标本的检测结果显示其灵敏度高，特异性 强。取人正常体细胞内p－球蛋白基困片段作细胞内参照，同时扩 增病毒目的基困片段和内参照，可用于监测单位细胞的带毒量，可 用于对鼻咽癌高危人群的筛查，并可能应用于该病的风险评估和疗 效观察。