论文部分内容阅读
目前,蛋白A亲和层析被普遍应用于抗体捕获,但该方法存在如配基脱落、价格昂贵等缺陷,一定程度上制约了该技术的规模化应用。多肽仿生层析技术作为一种潜在的蛋白A亲和层析替代方法,具有成本低、洗脱温和、耐酶解等优点,受到了广泛的关注。本文基于实验和计算机辅助方法,分析四肽仿生介质与抗体或杂蛋白间的相互作用,设计和筛选新型四肽仿生配基,探讨四肽仿生层析介质分离抗体的新工艺。首先将课题组前期筛选得到的5个四肽仿生配基(Ac-HYRF,Ac-HWRH,Ac-YHRI,Ac-FHRA,Ac-FYRH)通过空间臂偶联于琼脂糖凝胶基质上,考察这5种四肽介质对抗体的吸附性能。静态吸附实验表明,5种四肽介质对于人免疫球白蛋白(hIgG)和牛血清白蛋白(BSA)均具有较好的结合能力。经过进一步实验发现介质对BSA的吸附几乎完全依赖静电相互作用,而对于hIgG的结合则是由疏水相互作用和静电相互作用共同主导。另外,四肽介质Ac-FYRH-4FF对于含BSA的抗体料液,分离效果不理想,需要进一步的改进配基以提升分离效率。为提高四肽介质对抗体的吸附选择性,本文分别引入组氨酸、半胱氨酸和色氨酸替代精氨酸,设计出3个新型四肽配基Ac-FYCH、Ac-FYWH、Ac-FYHE。分子对接、静态/动态吸附和混合蛋白料液分离实验表明,Ac-FYHE配基对于hIgG具有较高的结合能力和吸附选择性。在pH 7.0条件下Ac-FYHE-4FF对hIgG的动态载量(Q10%)为24.1 mg/mL,而对于BSA仅只有2.1 mg/mL。从hIgG和BSA的混合蛋白料液中分离hIgG,得到纯度和收率分别达到93.4%和92.1%。最后,深入考察了 Ac-FYHE-4FF介质的吸附性能。结果表明,配基密度越高,抗体的吸附量越大,但配基的吸附效率有所下降。添加0.5 MNaCl,吸附量下降低于20%。而添加50%乙二醇,吸附量下降70%左右,说明疏水相互作用主导了 Ac-FYHE-4FF介质与hIgG之间的结合。以hIgG和BSA模型蛋白,确定在pH 7.5和pH 3.5～5.0分别为抗体最佳的上样和洗脱条件。进一步将Ac-FYHE-4FF层析柱应用于从CHO细胞培养上清液以及人血清中一步分离单抗mAb或hIgG,得到抗体纯度和收率均大于90%。显示了 Ac-FYHE-4FF介质分离纯化抗体的应用潜力。本文围绕四肽仿生层析,设计并筛选到对于抗体具有较高吸附选择性的新型四肽配基Ac-FYHE,并成功应用于抗体初步分离,有助于多肽仿生层析方法在抗体分离纯化过程中的推广和应用。