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目的:Ly-GDI,又称D4-GDI、RhoGDI2或RhoGDIβ,是RhoGDP解离抑制因子家族的成员之一,其对细胞凋亡及侵袭等很多方面都起到调节作用。本实验构建miR-34b慢病毒载体,外源性恢复miR-34b在人乳腺癌MDA-MB-231和MCF-7细胞中的表达,研究其联合射线对细胞增殖、凋亡、侵袭及迁移的影响,并进一步探讨miR-34b对Ly-GDI及其相关信号通路分子的调控作用机制。 方法: 1.设计合成miR-34b前体序列,经退火及磷酸化后形成二聚体。pLentiLox3.7(pLL3.7)质粒经双酶切后与miR-34b连接,菌体PCR以及质粒PCR产物经琼脂糖凝胶电泳验证,同时测序验证其正确性;脂质体法将构建的质粒载体与包装质粒pVSVG、△8.9共转染293T细胞,收集病毒液并用梯度稀释法检测重组慢病毒的滴度;用构建好的慢病毒载体感染人乳腺癌 MDA-MB-231和 MCF-7细胞并观察感染效率。 2.绘制miR-34b慢病毒感染或不同剂量 X线照射后的细胞生长曲线;MTT比色法和克隆形成法分析细胞增殖情况;Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒染色,流式细胞仪检测细胞凋亡情况;western blot检测凋亡相关信号通路蛋白如Ly-GDI和Bcl-2的表达情况。 3.体外划痕实验观察miR-34b联合电离辐射对MDA-MB-231和MCF-7细胞运动能力的影响;Transwell实验检测miR-34b联合电离辐射对细胞侵袭以及迁移能力的影响;western blot检测Ly-GDI以及相关信号通路蛋白如MMP-2、integrin-β1、RhoA的表达情况。 结果: 1.测序结果证实本实验构建的慢病毒质粒载体序列完全正确(100%匹配),梯度稀释法测得pLL3.7-miR-34b的滴度为7.81×107TU/mL,pLL3.7-miR-NC的滴度为2.38×108TU/mL;荧光显微镜观察到pLL3.7-miR-34b及pLL3.7-miR-NC对MDA-MB-231和MCF-7两种细胞的感染效率均达到了95%以上。 2.miR-34b慢病毒感染3d后对MDA-MB-231和MCF-7细胞的生长有抑制作用,并且细胞形态发生了变化;MDA-MB-231和MCF-7两种细胞的生长速度分别在受到2、4、6GyX线照射后5、3、2d变慢,而且前者受到的抑制作用大于后者;MTT和克隆实验结果证实miR-34b联合射线抑制MDA-MB-231和MCF-7细胞的增殖;流式细胞仪检测到miR-34b联合射线促进MDA-MB-231和MCF-7细胞的凋亡能力;western blot检测到miR-34b联合电离辐射后MDA-MB-231细胞中Ly-GDI和Bcl-2蛋白表达下调,而MCF-7细胞中未检测到Ly-GDI的表达,但Bcl-2的表达下调。 3.体外划痕实验证实miR-34b联合射线降低MDA-MB-231细胞的运动能力,而对MCF-7细胞的运动能力无影响;Transwell侵袭以及迁移实验证实miR-34b联合射线可以抑制MDA-MB-231细胞的侵袭及迁移能力,而对MCF-7细胞无影响;western blot检测到miR-34b联合电离辐射后MDA-MB-231细胞中与侵袭迁移相关蛋白Ly-GDI、MMP-2、integrin-β1、RhoA的表达下调,而MCF-7细胞中未检测到Ly-GDI的表达,其他蛋白的表达也无变化。 结论: 1.成功构建miR-34b慢病毒载体,并且对MDA-MB-231和MCF-7两种细胞的感染效率均达到了95%以上。 2.外源性恢复miR-34b在MDA-MB-231和MCF-7细胞中的表达,并联合射线处理,其能够通过下调Ly-GDI、Bcl-2等靶基因的蛋白表达来抑制细胞的增殖、促进细胞凋亡。 3.miR-34b在MDA-MB-231细胞中外源表达并联合辐射后,能够通过下调Ly-GDI、MMP-2、integrin-β1、RhoA等蛋白的表达来抑制细胞的侵袭及迁移能力。