目的:慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulomonay disease,COPD）是一种以持续气流受限为特征的慢性呼吸道疾病,病程进行性发展,全球发病率高达15.5%,已成为全球第三大死亡原因。细菌性呼吸道感染,尤其铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginiosa）是导致COPD患者急性加重甚至死亡最主要的因素。抗生素是目前最常用的预防和治疗呼吸道感染的方法。P.aeruginosa在组织黏膜表面定植后,极易形成生物膜。P.aeruginosa包埋在含有大量藻酸盐、多糖编码基因座和多糖合成基因座的胞外多糖聚合物基质内,从而保护P.aeruginosa免受抗生素的干扰,不仅加大了治疗的难度,也提高了患者病情加重甚至死亡的风险。牙周炎是以牙菌斑生物膜为始动因素,发生于牙周支持组织的慢性感染性疾病,与COPD等呼吸系统疾病密切相关。研究证实牙菌斑是呼吸道致病菌的储存库,吸入含有呼吸道致病菌定植的牙菌斑团块是牙周致病菌引发或加重呼吸道感染的主要途径。具核梭杆菌（Fusobacterium nucleatum）是口腔固有菌群,亦是公认的牙周重要致病菌。近来研究发现F.nucleatum能够定植于下呼吸道,是引发呼吸道感染的病原菌。Tan等研究发现COPD患者的肺功能随着患者牙周健康状况变差而逐渐减弱。通过机械清洁或抗菌剂改善口腔健康状况能够显著降低患者病情急性加重的频率和死亡的风险。因此,我们推测牙周致病菌F.nucleatum在呼吸道定植后,可能会改变呼吸道菌群的结构、致病性和抗生素敏感性,继而加重呼吸道感染。F.nucleatum的典型特征是拥有大量的外膜蛋白（又称黏附素）,可以介导F.nucleatum与口腔内几乎所有细菌的共聚,亦可介导F.nucleatum黏附于多种组织细胞。梭杆菌黏附素A（Fusobacterium adhesin A,FadA）是一种口腔梭杆菌特有的黏附素,以未分泌的pre-FadA和分泌的成熟型FadA（mFad A）两种形式存在,pre-FadA和mFadA聚合形成的高分子量复合物（FadAc）具有介导F.nucleatum黏附与定植宿主细胞的能力。FadA直接与血管内皮细胞钙黏蛋白结合,改变钙黏蛋白的细胞定位,破坏细胞连接,进而增加血管内皮的通透性,使F.nucleatum穿透血管内皮,造成血源性播散。FadA可以与结肠癌上皮细胞钙黏蛋白结合,激活β-catenin信号通路,继而促进结肠癌发生发展。目前,FadA是否能够介导与F.nucleatum和其他种属细菌的相互作用尚不明确。因此,我们推测FadA在F.nucleatum引发或加重呼吸道感染过程中发挥一定的调控作用,同时,FadA可能会介导细菌F.nucleatum与P.aeruginosa之间的相互作用。基于以上的研究背景和思考,本研究首先利用临床样本验证COPD急性加重期患者的呼吸道内是否存在F.nucleatum和P.aeruginosa的联合感染,以及F.nucleatum的存在和含量是否会影响COPD患者的肺通气功能;其次,分别从细菌之间相互作用（F.nucleatum和P.aeruginosa）及细菌与肺上皮细胞间相互作用（F.nucleatum和/或P.aeruginosa与肺上皮细胞）两个方面,阐述口腔来源的牙周致病菌F.nucleatum干扰呼吸道致病菌P.aeruginosa生物膜形成能力和抗生素敏感性的机制,探讨F.nucleatum和P.aeruginosa联合感染对肺上皮细胞生物学功能的影响,并揭示F.nucleatum调控肺上皮细胞周期和炎症反应的机制。最后,明确Fad A在细菌间相互作用（F.nucleatum调控P.aeruginosa抗生素敏感性）及细菌与肺上皮细胞间相互作用（F.nucleatum诱导肺上皮细胞炎症反应）过程的调控作用。本研究期望通过揭示细菌间相互作用及其对肺上皮细胞生物学功能的调控机制,从口腔干预的角度为预防和治疗COPD患者呼吸道感染提供新的抗感染策略。研究方法:1.收集53例COPD急性加重期患者气管吸出物,qPCR法扩增细菌16S rRNA检测COPD患者气管吸出物内F.nucleatum和P.aeruginosa定植与含量,并评估COPD患者肺功能指数（FEV₁%）与F.nucleatum在呼吸道菌群内含量的相关性。2.收集F.nucleatum上清液,体外纯化FadA蛋白,分别建立F.nucleatum、F.nucleatum上清液和FadA蛋白处理P.aeruginosa生物膜的体外模型。菌落计数法评估细菌增殖能力并检测培养基内pH变化;扫描电镜和结晶紫染色法分别观察细菌生物膜结构和生物膜量变化;RT-PCR法检测P.aeruginosa胞外多糖调控基因algD,pelB和pslA表达变化;选取亚胺培南、美罗培南、庆大霉素、阿卡米星、环丙沙星和左氧氟沙星6种临床常用抗生素,通过K-B纸片扩散法及测量抗生素的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度,评估P.aeruginosa抗生素敏感性。3.建立F.nucleatum和P.aeruginosa单独或共同感染肺上皮细胞（A549细胞）的体外模型,检测细菌的黏附和侵入效率;光学显微镜、透射电镜和扫描电镜观察细菌黏附侵入形式和细胞形态变化;CCK8法检测细胞增殖能力;LDH检测细胞毒性;Calcein-AM/PI双染法观察活细胞和死细胞数量;流式细胞术检测细胞周期变化;酶联免疫吸附试验检测IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α分泌;Wesetern blot检测p-NF-κB、NF-κB、p-STAT3和STAT3蛋白表达。4.RNA测序技术筛查F.nucleatum感染A549细胞的差异表达m RNA和miRNA;利用webgestalt软件对差异表达mRNA进行GO和KEGG通路富集分析;STRING数据库结合Cytoscape软件构建蛋白互作网络并筛选出重要的蛋白互作功能模块和hub基因;利用hTFtarget数据库分析核心转录因子,构建转录因子-mRNA调控网络;利用miRWalk、miRDB和TargetScan软件预测miRNA靶基因,构建miRNA-mRNA调控网络和转录因子-miRNA调控网络。5.利用体外纯化Fad A蛋白处理肺上皮细胞,明确FadA在F.nucleatum感染肺上皮细胞过程中的调控作用。结果:1.本研究所募集的COPD急性加重期患者中,45.3%患者存在F.nucleatum和P.aeruginosa的联合感染,并且随着F.nucleatum在呼吸道菌群内含量的不断升高,患者的肺功能指数呈现逐渐下降趋势。2.F.nucleatum和P.aeruginosa双菌株体外共培养模型显示,F.nucleatum和P.aeruginosa相互作用,使培养基由弱碱性转变为弱酸性,促进彼此在浮游状态和生物膜内的增殖,增强pelB和pslA表达,形成致密而复杂的双菌种生物膜,进而降低了生物膜对抗生素美罗培南,阿米卡星,庆大霉素和环丙沙星的敏感性。3.FadA能够增强P.aeruginosa生物膜形成能力,增强pelB和pslA表达,降低P.aeruginosa生物膜对阿米卡星,庆大霉素和环丙沙星的敏感性。4.P.aeruginosa和F.nucleatum对肺上皮细胞的黏附和侵入效率随细菌的感染复数升高而升高;二者同时感染可显著提高彼此的侵入效率。5.P.aeruginosa和F.nucleatum单独或共同感染肺上皮细胞,细菌的黏附位点和细胞形态发生不同的改变。P.aeruginosa倾向于附着在细胞连接处,破坏细胞连接,使细胞皱缩变圆;F.nucleatum自身聚集形成网团状结构,附着在细胞表面,细胞形态拉伸呈长梭形;P.aeruginosa和F.nucleatum联合感染,P.aeruginosa和F.nucleatum共聚,黏附在细胞连接和细胞表面,细胞形态变圆。6.P.aeruginosa单独感染（MOI 10、50和100）可抑制肺上皮细胞增殖、诱导细胞死亡,增强IL-1β和IL-6分泌;F.nucleatum单独感染（MOI 100）可促进细胞的增殖（8小时）、对细胞的毒性和死亡没有显著影响,但可显著增强IL-1β、IL-6和TNF-α分泌且显著高于MOI 10和50组;P.aeruginosa和F.nucleatum共同感染诱导的肺上皮细胞毒性反应低于P.aeruginosa单独感染,但IL-6和TNF-α分泌显著高于P.aeruginosa单独感染。7.RNA测序联合生物信息学分析提示F.nucleatum能够通过FadA与CDH11结合,黏附并侵入肺上皮细胞,激活CDH11/EGFR/MAPK13/JUN/mi R-27b-5p信号回路,循环放大肺上皮细胞炎症反应;同时,F.nucleatum抑制AURKA/STAT3/E2F通路,降低MCM3-7、CCNA2和CCNB1表达,诱导肺上皮细胞S期和G2/M期阻滞。结论:1.F.nucleatum是伴有P.aeruginosa感染的COPD患者肺功能减弱的生物标志物,F.nucleatum能够通过FadA促进P.aeruginosa胞外多糖调控基因pelB和pslA表达,降低P.aeruginosa对美罗培南、庆大霉素、阿卡米星和环丙沙星的敏感性。因此,靶向FadA干扰生物膜结构或抑制胞外多糖合成,将成为治疗伴有F.nucleatum和P.aeruginosa联合感染的COPD患者的新策略。2.F.nucleatum和P.aeruginosa联合感染肺上皮细胞,F.nucleatum能够抑制P.aeruginosa诱发的细胞毒性损伤,增强肺上皮细胞的炎症反应,这可能是F.nucleatum导致伴有P.aeruginosa感染的COPD患者呼吸道感染加重甚至迁延不愈的重要原因。3.F.nucleatum能够通过FadA与CDH11结合,黏附并侵入肺上皮细胞,激活CDH11/EGFR/MAPK13/JUN/mi R-27b-5p信号回路,循环放大肺上皮细胞炎症反应;同时,F.nucleatum抑制AURKA/STAT3/E2F通路,降低MCM3-7、CCNA2和CCNB1表达,诱导肺上皮细胞S期和G2/M期阻滞。因此,靶向FadA或封闭CDH11/EGFR/MAPK13/JUN/miR-27b-5p炎症回路和AURKA/STAT3/E2F信号通路,将成为治疗COPD患者呼吸道F.nucleatum感染的新策略。