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背景:肿瘤微环境(tumor environment,TME)与肿瘤的恶性生物行为密切相关,其中癌相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblasts,CAFs)是TME中最主要的基质细胞,发挥着举足轻重的作用。前期我们通过对乳腺肿瘤癌旁成纤维细胞(normal fibroblasts,NFs)与CAFs的mRNA和miRNA芯片分析及生物信息学分析,发现与NFs相比,乳腺癌CAFs存在共济失调毛细血管扩张突变基因(ataxia telangiectasia mutation,ATM)信号通路的异常活化,其糖代谢基因谱也发生了改变(与糖酵解过程相关的基因表达上调,与氧化磷酸化过程相关的基因表达下调)。目的:探讨(1)CAFs中主要代谢模式的改变。(2)CAFs是否存在不同于传统DNA双链损伤(DNA double-breaks,DSBs)途径激活的ATM活化(即氧化型ATM,oxidized ATM)。(3)氧化型ATM对CAFs糖酵解过程的介导作用。(4)氧化型ATM如何调控下游基因在CAFs糖酵解过程中发挥作用。(5)CAFs是否通过氧化型ATM介导的糖酵解所产生的代谢产物(乳酸)促进癌细胞迁移侵袭。(6)糖酵解产物乳酸促进癌细胞迁移侵袭的具体机制。(7)CAFs中氧化型ATM介导糖酵解分泌乳酸对肿瘤生长和转移的影响。方法:(1)从临床乳腺癌病人的标本组织中原代培养出三对NFs和CAFs,利用Q-PCR,WB(蛋白免疫印迹技术)以及免疫荧光技术对其进行标志物鉴定。(2)检测NFs和CAFs的OCR(氧气消耗率)和ECAR(细胞外酸化速率),利用JC-1试剂盒测定NFs和CAFs的线粒体膜电位。(3)WB(蛋白免疫印迹技术)和免疫荧光染色证明低氧条件下CAFs中氧化型ATM的激活;使用KU60019和shRNA降低氧化型ATM活性后,分别用试剂盒测定其葡萄糖消耗和乳酸生成。(4)质谱鉴定氧化型ATM对下游蛋白GLUT1 S490位点的磷酸化,co-IP(免疫共沉淀)实验,体外激酶实验,WB实验检测氧化型ATM对GLUT1 S490位点的磷酸化作用;免疫荧光染色和膜蛋白WB检测显示氧化型ATM磷酸化GLUT1 S490位点对其转位至细胞膜的影响;WB实验和免疫荧光染色检测氧化型ATM对PKM2蛋白表达的调控。(5)利用shRNA稳定敲低CAFs中ATM蛋白表达,收集CAFs条件培养基,将其与癌细胞(MDA-MB-231和BT-549)共培养,Transwell实验检测癌细胞侵袭能力,在CAF-shATM的条件培养基中添加外源性乳酸,再次检测与之共培养的癌细胞的侵袭能力:进一步阻断CAFs的糖酵解过程(GLUT1 S490位点磷酸化失活,shRNA稳定敲低PKM2表达),检测CAFs的葡萄糖消耗和乳酸生成,将其条件培养基与癌细胞共培养,检测癌细胞侵袭能力;阻断CAFs中向癌细胞运输乳酸的过程(shRNA稳定敲低CAFs中MCT4蛋白,shRNA稳定敲低癌细胞中MCT1蛋白),将条件培养基与癌细胞共培养,检测其侵袭能力。(6)WB检测上述处理的癌细胞中与侵袭相关信号通路的变化,评价乳酸是否通过活化信号通路促进侵袭;利用shRNA稳定敲低CAFs中ATM表达,取其条件培养基与癌细胞共培养,检测癌细胞线粒体氧化磷酸化活性;在在CAF-shATM的培养基中添加外源性乳酸,癌细胞与之共培养,再次检测其线粒体氧化磷酸化活性;利用抗线粒体药物寡霉素作用于癌细胞,测定其线粒体氧化磷酸化活性以及相应侵袭能力的变化。(7)将裸鼠分成不同的处理组,利用基因重组细胞CAF/sh-Ctrl及CAF/sh-ATM、CAF/sh-MCT4与乳腺癌细胞MDA-MB-231混合,用于皮下成瘤建立动物模型,并利用药物2-DG干扰CAFs糖酵解过程,或者CHC阻断癌细胞吸收乳酸,或者恢复乳酸供应。检测裸鼠瘤体的大小和生长曲线,HE染色观察和统计小鼠的肺转移情况,并利用WB技术和免疫组化染色检测肿瘤组织中相关信号通路的活性。结果:(1)与NFs相比,CAFs氧化磷酸化过程的氧气消耗率降低,糖酵解过程的细胞外酸化速率增加,且JC-1检测到CAFs膜电位下降,说明CAFs的代谢模式更多依赖于糖酵解。(2)处于低氧8h条件下,检测到CAFs中ATM蛋白的激活,即p-ATM(s1981)蛋白的表达,且细胞中不存在DNA双链损伤(未检测到相关标志蛋白γH2AX和CHK2(T68)的表达)。利用顺铂药物处理CAFs后作为DSBs的阳性对照,WB检测到CAFs中DSBs相关标志蛋白的表达(γH2AX和CHK2(T68))免疫荧光染色观察到细胞中出现DNA双链损伤(CAFs细胞中53BP1和γH2AX的细胞核荧光形成),而低氧处理8h的CAFs中则不出现。利用抗氧化剂清除CAFs中由低氧产生的ROS,氧化激活的ATM降低。以上结果均表明低氧8h条件下,CAFs存在低氧激活的与DSBs修复非依赖的ATM活化(即氧化型ATM)。低氧处理CAFs后,氧化型ATM激活,细胞葡萄糖消耗和乳酸生成增加,糖酵解能力增加,利用ATM特异抑制剂KU60019,或者靶向ATM的shRNA抑制氧化型ATM活性后,细胞葡萄糖消耗和乳酸生成减少,糖酵解能力减弱,结果提示氧化型ATM介导CAFs糖酵解增强。(3)质谱鉴定到氧化型ATM磷酸化GLUT1蛋白S490位点,且此位点在人和其他物种中具有高度保守性。利用CO-IP实验我们证实了氧化型ATM能够磷酸化GLUT1蛋白,体外激酶实验同样证实低氧激活的氧化型ATM能够直接磷酸化GLUT1 S490位点,且GLUT1发生点突变使其位点S490变为S490A(磷酸化失活型),则氧化型ATM失去对GLUT1位点的磷酸化作用。WB检测到低氧条件下,CAFs中p-GLUT1(S490)蛋白水平增加,且使用抑制剂KU60019后,蛋白水平降低。利用点突变技术构建质粒并以此转染内源性GLUT1敲低的CAFs,获得基因工程重组细胞CAF-ecto WT和CAF-ecto S490A。与常氧条件相比,低氧条件下,CAF-ecto WT中p-GLUT1(S490)蛋白水平增加,而CAF-ecto S490A中p-GLUT1(S490)的蛋白水平在常氧或低氧条件下均很低。以上结果表明氧化型ATM能够磷酸化GLUT1的S490位点。利用免疫荧光染色技术,我们发现低氧处理后,CAFs中GLUT1转位到细胞膜增多,而利用抑制剂KU60019后,GLUT1转位到细胞膜减少。同样的,低氧条件下CAF-ecto WT中GLUT1转至细胞膜增多,抑制剂KU60019可以抑制该现象,CAF-ecto S490A中GLUT1在常氧,低氧条件下以及使用抑制剂处理均不能转位至细胞膜。同时检测细胞的葡萄糖消耗和乳酸生成,发现膜转位增加后,葡萄糖消耗以及乳酸生成增加。使用WB检测CAFs中膜蛋白的GLUT1表达也同样发现低氧激活的氧化型ATM通过磷酸化GLUT1的S490位点促进其转位至细胞膜。利用WB和免疫荧光染色检测到低氧情况下,CAFs中PI3K/AKT通路活性增加,PKM2表达上调,使用KU60019抑制剂或敲低ATM表达,PI3K/AKT通路活性降低,PKM2表达减少,即氧化型ATM通过PI3K/AKT通路调控PKM2的表达。(4)利用shRNA敲低CAFs中ATM蛋白表达,癌细胞(MDA-MB-231和BT-549)与之共培养后侵袭能力下降,在CAF/sh-ATM的条件培养基中添加外源性乳酸,与之共培养的癌细胞的侵袭能力恢复,进一步阻断CAFs的糖酵解过程或者阻断CAFs中向癌细胞运输乳酸的过程,共培养的癌细胞获取乳酸减少,其侵袭能力相应减弱。(5)在上述条件下与条件培养基共培养后,检测癌细胞中TGFβ1/p38 MAPK/MMP2/9信号通路的变化,结果显示:癌细胞与ATM敲低的CAFs源性的条件培养基共培养,TGFβ1/p38 MAPK/MMP2/9信号通路活性降低;在条件培养基中补充外源性乳酸后,该信号通路活性恢复;阻断CAFs的糖酵解过程或者阻断CAFs中向癌细胞运输乳酸的过程,共培养的癌细胞获取乳酸减少,与侵袭能力减弱一致,癌细胞的信号通路活性降低。以上结果提示CAFs中氧化型ATM介导的糖酵解增强,乳酸量增加,CAF源性的乳酸通过激活TGFβ1/p38 MAPK/MMP2/9信号通路促进癌细胞侵袭。将CAF-shATM的条件培养基与癌细胞共培养,检测到癌细胞线粒体氧化磷酸化活性降低;在条件培养基中添加外源性乳酸,癌细胞的线粒体氧化磷酸化活性恢复;利用抗线粒体药物寡霉素作用于癌细胞,其线粒体氧化磷酸化活性降低,其侵袭能力相应地减弱,结果显示乳酸可以通过激活癌细胞线粒体氧化磷酸化活性促进其侵袭。(6)裸鼠移植瘤模型研究揭示敲低CAFs中ATM表达或使用2-DG抑制糖酵解过程,以及使用shRNA敲低CAFs中MCT1表达或使用CHC阻断CAFs中的乳酸运输至癌细胞,裸鼠移植瘤生长及肺组织转移能力明显减弱,而添加外源性乳酸恢复乳酸供应后,肿瘤生长和肺转移能力可以得到恢复。结论:(1)CAFs的代谢更多依赖于糖酵解过程。(2)低氧条件下CAFs存在低氧激活的不参与DSBs途径的ATM的氧化活化(即氧化型ATM),且氧化型ATM能够介导CAFs糖酵解增强。(3)氧化型ATM磷酸化GLUT1的S490位点促进其转位至细胞膜并通过PI3K/AKT通路调控PKM2的表达。(4)氧化型ATM介导糖酵解产生的乳酸通过激活癌细胞中TGFβ1/p38 MAPK/MMP2/9信号通路和增强线粒体氧化磷酸化活性而促进其侵袭能力。(5)氧化型ATM介导CAFs糖酵解产生乳酸促进肿瘤恶性生长和转移侵袭。