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童期的发育机理一直是木本植物育种进程中备受瞩目的问题,尤其是对一些具有重要经济价值的林木和收获果实为目的的果树来说。如何缩短童期进而提高育种效率,一直是果树分子生物学研究的重要课题。20世纪70年代末在我国宜昌境内发现的一株早花的枳壳突变体,该突变体在播种后第一年就有20%的开花,第三年全部开花,并且可以在一年内多次开花。与普通枳相比,其童期大大缩短,正是因为这个特性而被命名为早实枳(precocious trifoliate orange, Poncirus trifoliata (L.)Raf.)。早实枳短童期阶段的特性为研究木本植物童期发育的分子机理提供了一个宝贵的材料。早期的果树成花研究主要集中于生理生化方面,包括环境因子及栽培技术措施对实生苗成花的影响等,而对果树开花的分子机制及其遗传调控的研究相对较少。本课题主要对从早实枳中分离的两个控制木本植物童期发育的关键基因(PtTFL1和PtTFL2)进行了生物信息学分析,通过实时定量研究了这两个基因在不同环境因子影响下的响应,并通过在不同基因型的烟草中表达进行功能验证。研究主要结果如下：1.通过生物信息学分析发现,在PtTFL1和PtTFL2的全长序列内都存在4个外显子和3个内含子,均编码一个173个氨基酸读码框,预测的分子量分别为19.5kDa和19.2kDa,等电点分别为9.24和8.79；并在读码框内均存在1个PEBP motif,而且在两个序列内,PEBP家族基因的两个关键位点His88(85位组氨酸)和Asp144(140位天冬氨酸)都保守。在核苷酸水平上与甜橙CiTFL分别有98%和71%的一致性；此外,PtTFL1和PtTFL2在核苷酸序列上有77%一致性。2.对早实枳通过光周期、GA3和不同的温度处理后,并通过实时定量检测了PtTFL1和PtTFL2对这些环境因子的响应。结果显示：在短日照和低温处理后,两个基因均呈现下降的表达趋势。而当经过长日照、GA3和冷处理后,虽然在开花过程中两个基因的功能相似,但是其表达水平却呈现了相反的表达模式,可能是这两个基因在开花过程中的功能是通过不同的调控模式来实现的,从而导致了对一些因素的响应不同。3.烟草叶片和早实枳茎段对HygB的敏感性检测结果显示：它们都对HygB敏感,结合本次实验结果及考虑到抗生素对外植体的伤害,初步确定Nicotiana tabacum Linn叶片在转基因过程中对HygB的筛选压为5mg/L,Nicotiana nudicaulis叶片筛选压为2.5mg／L,早实枳茎段筛选压为2.5mg／L,为下一步利用HygB进行筛选转化植株提供依据。4.为了研究PtTFL1和PtTFL2的功能特征,分别在两种烟草N. nudicaulis和N. tabacum Linn中超表达,通过PCR及RT-PCR鉴定两种转化烟草发现,在N. nudicaulis的转化植株中：PtTFL1有27株呈现了阳性,阳性率为90%,PtTFL2有38株呈现了阳性,阳性率为47.5%；PtTFLl和PtTFL2的T0代植株与对照相比,除了2株较野生型早开花,其余均出现了不同程度的晚花,转基因植株平均比野生型晚20d左右开花,转PtTFL1植株比转PtTFL2植株早开花约2d的时间。在N. tabacum Linn的转化株中：PtTFL1有5株呈现了阳性,阳性率为83.3%,PtTFL2有11株呈现了阳性,阳性率为61.1%；PtTFL1和PtTFL2转化植株均比野生型晚开花,而最初的差异主要表现在腋芽和节间长度方面,转化PtTFLl的植株茎基部均有大量腋芽发生,并且节间短,而转化PtTFL2的植株则没有腋芽发生,节间较长。5.进行了初步的PtTFL1和PtTFL2转化早实枳的探索,均获得了8株抗性苗,分别选取6株进行微芽嫁接,剩余的2株选择直接生根。由于时间的限制,未能对这些转化植株进行分析,但是为进一步在早实枳中研究PtTFL1和PtTFL2的功能奠定了基础。