荧光分析方法由于其便捷的信号输出模式、较高的灵敏度和较少的样品需求量等优点,在化学分析、环境监测和生物成像等方面有着广泛的应用前景。传统的荧光分析方法主要是利用有机染料分子作为荧光标记物。有机染料具有成本低廉、分子量小和易于标记等优点,但仍存在一些难以克服的缺陷,如激发光谱窄、发射光谱宽且有拖尾,稳定性差、容易漂白等,因而在实际应用中受到很大的限制。近年来,随着纳米技术的发展,许多基于纳米材料的荧光标记物被不断发现。利用纳米材料作为标记物,不仅能有效克服传统标记物的缺陷,还呈现出常规染料不具备的优越性能,为荧光分析方法提供了一种新的视野。在已报道的荧光纳米材料中,荧光金属纳米簇(纳米颗粒)由于其独特的光学性质和简易的合成方法吸引了人们的广泛关注。核酸分子由于具有良好的纳米结构、丰富的功能基团、及可人为编码的序列信息,被广泛用于荧光金属纳米颗粒的合成。目前以DNA为模板合成银纳米簇的技术已比较成熟,但是利用DNA为模板合成铜纳米颗粒和金纳米簇的报道还比较少。基于此,本论文以探究模板DNA序列与铜纳米颗粒合成、金纳米簇合成的关系为目标,设计和考察了多种不同DNA序列用于铜纳米颗粒和金纳米簇的合成。并在此基础上发展了多种免标记纳米荧光探针用于蛋白酶、小分子、离子的分析检测。具体包括以下工作:一、poly(AT-TA)依赖双链DNA介导荧光铜纳米颗粒的合成及其性质研究为了鉴定模板序列组成在双链DNA介导荧光铜纳米颗粒合成中的影响,我们系统地考察了各种各样的双链DNA与荧光铜纳米颗粒合成能力之间的关系。铜纳米颗粒的荧光强度和量子产率被用于判断不同模板的合成效率。通过系统地筛选和考察,聚腺嘌呤-胸腺嘧啶相间的双链DNA(poly(AT-TA))被发现能作为非常高效的模板用于铜纳米颗粒的合成,而其他双链DNA用作模板时,其合成效率很低或几乎没有合成能力。双链DNA介导合成的荧光铜纳米颗粒的荧光强度与poly(AT-TA)的聚合度、长度、浓度均有明显的正相关性。这些结果将有利于人们更好的理解碱基组成对铜纳米颗粒合成的影响,有助于今后铜纳米颗粒应用时对模板序列的设计等。二、双链DNA-荧光铜纳米颗粒作为一种“绿色”纳米染料用于聚合酶相关的生化分析研究在上述模板序列考察的基础上,我们利用双链DNA-荧光铜纳米颗粒优异的光学性质、简易的合成过程及良好的生物相容性等特点,结合铜纳米颗粒对模板序列类型的依赖性,发展了一种新颖、免标记的荧光方法用于聚合酶相关的生化分析。当被分析物(聚合酶或汞离子)存在时,单链DNA可延伸成双链DNA,从而高效的合成荧光铜纳米颗粒。而当靶标不存在时,单链模板不能发生延伸反应,短的引物和单链DNA不能介导荧光铜纳米颗粒的合成,通过铜纳米颗粒荧光的变化即可检测相应的靶标物。此外,通过利用铜纳米颗粒对双链DNA的依赖性,该方法还可用于其他可诱导聚合延伸反应的靶标。与核酸染料相比,该方法所用试剂绿色环保、无毒、价格低廉;与染料标记的分子探针相比,该方法设计简单、操作简便且不需要标记。因此,该工作将促进双链DNA-铜纳米颗粒在生物化学及生物医学等领域的应用。三、哑铃型DNA介导合成的铜纳米颗粒作为一种纳米荧光探针用于连接修复相关酶的检测研究基于双链DNA和特殊单链DNA都能合成荧光铜纳米颗粒的特点,我们设计了一个哑铃型DNA模板用于荧光铜纳米颗粒的高效合成,并进一步将其用于连接修复相关酶的分析。在这条哑铃型模板中,哑铃颈部被设计成poly(AT-TA),哑铃的环部被设计成聚胸腺嘧啶(poly(T))。由于poly(AT-TA)和poly(T)都是能高效合成铜纳米颗粒的模板DNA,因此用哑铃型DNA合成的铜纳米颗粒也表现出极高荧光强度和优异的荧光稳定性。然后,我们利用哑铃型DNA中间的缺口和外加的核酸外切酶,将此探针用于DNA连接酶的免标记检测。基于T4连接酶连接反应对5‘末端磷酸化的依赖,我们又将该方法用于T4多核苷酸激酶的检测。无论是T4连接酶还是T4核苷酸激酶的检测,该方法的原理都是基于靶标对哑铃型DNA的封闭,从而抵抗外切酶的水解。该纳米探针不仅实现了缓冲液中靶标酶的免标记检测,在复杂样中也有很好的检测能力和线性关系。除了实现对连接酶和核苷酸激酶的检测外,我们还将此纳米探针用于对DNA磷酸酶的检测,也取得很好的检测效果。该工作不仅扩宽了 DNA-铜纳米颗粒在DNA修复酶上的应用,也将促进更多的纳米探针应用于生化分析。四、单链DNA介导荧光金纳米簇的快速合成及其汞离子免标记检测研究为了考察模板序列组成与DNA介导合成的金纳米簇之间的关系,我们以羟乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)为还原剂,发展了一种简单、快速、温和的策略用于DNA-金纳米簇的快速合成。通过系统的筛选和考察,5个碱基长度的聚胞嘧啶(C5 DNA)被发现在本体系中能高效的介导金纳米簇合成,整个合成过程在5分钟内即可完成。C5 DNA合成的金纳米表现出较亮的蓝色荧光和良好的稳定性,6小时内其荧光强度基本没有多大变化。此后,我们进一步将制得的DNA-金纳米簇作为一种免标记的纳米探针用于汞离子的检测,由于汞离子与金纳米簇表面金离子的特定作用,该探针对汞离子检测表现出好的选择性和检测能力,实际水样检测也有较好的回收率。此外,由于DNA分子的广泛的识别能力,该DNA模板合成的金纳米簇可作为一种有潜力的纳米荧光探针用于其他目标物的分析检测。五、基于DNA介导合成的荧光金纳米簇和类芬顿反应用于铜离子免标记检测研究在上述对DNA-金纳米簇研究的基础上,我们进一步将DNA介导合成的金纳米簇用于铜离子的快速检测。在该方法中,我们引入了一个类芬顿反应,即在有氧的条件下,抗坏血酸不仅能还原铜离子,还能与氧气反应产生双氧水,然后双氧水与一价铜离子反应形成羟基自由基。类芬顿反应产生的羟基自由基能作为一种强氧化剂能高效猝灭金纳米簇的荧光,从而实现对铜离子的特异检测。该方法绿色环保、操作简单、且不需修饰和标记,整个检测过程在十分钟内即可完成。由于该类芬顿反应中铜离子与抗坏血酸之间的作用是特异的,因此本方法对铜离子检测有很好的选择性。该工作将进一步促进DNA-金纳米簇作为一种纳米荧光探针在生化分析等领域中的应用。