异育银鲫CyHV-2检测方法的建立及江淮主产区CyHV-2感染的分子流行病学调查

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由鲤疱疹病毒2型(CyHV-2)感染引起的鲫鱼疱疹病毒病是目前发现的唯一感染异育银鲫的病毒性疾病,2009年于江苏盐城地区发现后广泛流行,是自2005年异育银鲫“大红鳃”病后对异育银鲫养殖业造成巨大威胁的又一重大疾病。该病发病率高、死亡率高、传染性强、无有效的防治方法,成为我国异育银鲫养殖业的主要威胁。本研究建立了 CyHV-2 TaqMan荧光定量PCR(qPCR)快速检测方法和CyHV-2微滴式数字PCR(ddPCR)快速检测方法,并将其应用于对江淮异育银鲫主产区的分子流行病学调查,对qPCR检测为阳性的可疑样品再次用ddPCR对其进行复检;对2015年4月至10月期间江淮主产区的CyHV-2感染进行统计和分析,研究其流行传播规律,从而对预防和控制异育银鲫CyHV-2感染起到预警作用。本文主要围绕以下几方面进行研究:1.CyHV-2 TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立根据GenBank上发表的CyHV-2 ORF6基因序列(登录号:JQ815364.1)用Primer Express3.0设计并合成基因特异性引物及Taqman探针,探针以FAM为荧光报告基团,以BHQ荧光淬灭基团,建立了检测CyHV-2的qPCR检测方法。重复性试验的批内及批间的变异系数均小于1%,构建的标准曲线的R2值为0.995,最低检测浓度为18.8 copies/μL,表明建立的CyHV-2 qPCR快速检测方法特异性强,敏感性高,重复性好且具有良好的线性关系。2.CyHV-2 ddPCR快速检测方法的建立使用与qPCR检测方法相同的引物和探针,建立了快速检测CyHV-2 ddPCR检测方法,敏感度达3.77 copies/μL,其检测灵敏度比qPCR高出5倍,且特异性强,批内及批间的变异系数(CV)均小于3%,说明该方法的重复性好。ddPCR的标准曲线R2值为0.9975,表明ddPCR具有良好的线性关系。初步应用研究的结果表明,所建立的方法可用于异育银鲫CyHV-2感染的临床诊断和实验研究。3.异育银鲫江淮主产区CyHV-2感染的分子流行病学调查应用本文所建立的qPCR方法检测出CyHV-2阳性69份,可疑3份;ddPCR检测出CyHV-2阳性72份,qPCR检测结果为可疑的3份样品ddPCR检测结果均为阳性,且阴性对照结果为阴性、阳性对照结果为阳性,其他样品两种方法检测结果一致。综合两种方法结果为CyHV-2阳性72份,阳性率为17.1%,扬州地区阳性率最高,达60%,苏州地区未检出阳性。用CyHV-2 qPCR对同一阳性样品的肾脏、脾脏、腮、肝脏、心脏和脑6个组织部位进行检测,结果均为阳性,肾脏病毒含量最高,脑病毒含量较低。样品收集于2015年4月至10月,分别来自于安徽合肥,江苏盐城、无锡、扬州、苏州、常州和淮安地区主要养殖区养殖的异育银鲫。CyHV-2感染的流行区域主要集中在江淮主要养殖区,且以扬州、淮安和盐城地区为主,苗期、高发一期、稳定期、高发二期以及发病末期均有部分地区CyHV-2检测阳性,其中4月、5~6月以及9月发病率相对较高,7~8月以及10月发病率相对较低。本研究实验数据丰富了异育银鲫CyHV-2感染的分子流行病学的内容。
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