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与非生物催化剂相比,生物(酶)催化剂具有反应条件温和、反应速率快、催化作用专一等优点,因而它在工业中扮演的角色越来越重要。脂肪酶是一种重要的生物催化剂,其在催化过程中具有高度的区域选择性、立体选择性且在反应中不需要添加辅因子等特点,因而被广泛用于化合物的分解、合成和酯交换。然而野生型的脂肪酶产生菌的脂肪酶产量普遍不高限制了脂肪酶在工业中的应用。来自Burholderia ambifaria YCJ01的脂肪酶具有良好的热稳定性、优异的有机溶剂耐受性,在有机相催化方面具有广泛的应用前景,然而该菌株所产脂肪酶活力不高,故本研究拟通过诱变选育手段来提高脂肪酶产生菌产脂肪酶的能力。 以耐有机溶剂脂肪酶产生菌Burholderia ambifaria YCJ01为出发菌株,采用常压室温等离子(Atmospheric and Room Temperature Plasma,简称ARTP)技术对其进行诱变。以添加了1%的辛癸酸甘油酯的平板作为初筛平板,利用菌落周围透明圈直径(H)与菌落直径(D)比值的大小和水解圈的亮度初步衡量突变株产酶能力的高低。从285株初筛的突变株进行摇瓶复筛,其中一株具有良好遗传稳定性的产耐有机溶剂脂肪酶的突变株B.ambifaria YCJ01-b23,其脂肪酶酶活为184.1 U/mL,是原始菌株酶活的1.5倍。 对突变株B.ambifaria YCJ01-b23进行产酶发酵条件的优化,优化后的培养基成分为:糊精8 g/L,酵母粉3.2 g/L,牛肉膏7.5 g/L,硫酸镁0.5 g/L,磷酸氢二钾2 g/L,菜籽油5 mL/L,TritonX-1000.75mL/L,pH8.0。采用优化后的培养基进行发酵,其脂肪酶酶活力为202.4 U/mL,是出发菌株酶活的1.7倍。为利用开发B.ambifaria YCJ01来源的耐有机溶剂脂肪酶进行非水相催化奠定了一定的基础。 利用突变株B.ambifaria YCJ01-b23所产脂肪酶催化拆分对位取代α-苯乙醇衍生物,初步优化后的拆分体系是:以异丙醚为反应介质,采用乙酸乙烯酯作为酰基供体,对180 mmol/L的1-(4-甲基苯基)乙醇进行选择性酯化,脂肪酶粗酶粉添加量为5g/L,180 r/min,50℃条件下反应21h后,底物转化率可达49.9%,ees、eep分别为97.1%和97.2%,对映体选择性E>200;同样,对1-(4-甲氧基苯基)乙醇进行选择性酯化,酰基供体为丁酸乙烯酯,底物浓度150 mmol/L,脂肪酶粗酶粉添加量为2.5 g/L,180 r/min,30℃条件下反应12h后,底物转化率为49.8%,ees、eep分别为97.7%和98.4%,对映体选择性E>200。 本研究通过ARTP诱变Burholderia ambifaria YCJ01筛选到一株遗传稳定且酶活提高的突变株Burholderia ambifaria YCJ01-b23。利用来自该突变株的脂肪酶催化拆分对位取代α-苯乙醇,显示了很好的手性拆分效果。