论文部分内容阅读
本文分三部分论述了犬冠状病毒的感染特性及蛋白质组学:
第一部分利用A72细胞从经RT-nPCR检测阳性的腹泻犬粪样中分离CCV,经RT-nPCR和免疫荧光试验鉴定,成功分离到4株CCV野毒,分别命名为CCV KM、NJ2、NJ17、SH3。细胞适应性试验表明,分离到的野毒在A72、ST、PK细胞上增殖, KM株可导致A72细胞圆缩、脱落,而NJ2、NJ17、SH3在A72细胞上不产生明显的CPE。参考株CCV1-71及野毒KM、NJ2(第8代)都可在A72、MDCK、F81、crFK等细胞上增殖,只有KM株可在Vero细胞上增殖,并可见明显CPE。交叉保护试验证明,抗KM的血清不能中和其他的CCV毒株,抗CCV1-71的血清可以中和野毒KM、NJ2但是不能中和另外的CCV野毒株HC、DF、HF,说明CCV的毒株的交叉保护性很有限。对分离株的部分M基因测序表明,本研究分离的CCVNJ2、NJ17、sH3与猪传染性胃肠炎冠状病毒(TGEV)的同源性达93.4-97.2%)高于Ⅱ型猫冠状病毒(FCoV)代表株FIPV 79-1683(75.9-79.7%)。而KM在系统进化树上处于Ⅰ和Ⅱ型CCV之间,可能是一个新的变异株。
第二部分利用DNA荧光染料Hoechst 33258、细胞凋亡检测试剂盒及流式细胞仪技术对CCV分离株及参考毒株CCV1-71、TGEV感染的A72细胞、ST细胞进行了检测,以研究CCV感染对宿主细胞周期的影响。结果发现,在A72细胞上,分离毒株CCV KM、NJ2、NJ17和SH3几乎对细胞的周期没有影响,呈隐性感染状态,而作为对照的CCV1-71和TGEV可在感染的晚期检测到细胞凋亡现象。在ST细胞上,CCV分离株与TGEV在感染的早期未检测到细胞的凋亡和细胞周期明显改变,但是在感染晚期,可引起宿主细胞的凋亡。流式细胞仪检测结果发现,CCV可引起感染细胞在s期聚集。
第三部分建立了稳定的CCV1-71感染A72细胞体系。利用二维电泳技术对感染CCV1-71的A72细胞及同期对照细胞的细胞总蛋白进行分离,对表达有差异的蛋白质进行生物质谱检测(MALDI-TOF-Ms或二级串联质谱)分析。结果,48蛋白点与CCV感染有关,其中6个是病毒N蛋白,33个蛋白点的表达上调,9个蛋白点表达下调。本研究在蛋白质的水平上揭示了宿主细胞对感染CCV的应答。CCV感染后,细胞内的转录翻译活动活跃,多种hnRNP表达上升和翻译延伸因子表达有升有降。同时,细胞启动对病毒感染的应激活动,表现为热休克蛋白、TCP1、硫氧还蛋白及抗过氧化蛋白等分子伴侣蛋白表达上调。腺苷酸环化酶降低,而丝氨酸/苏氨酸受体相关蛋白表达上升,说明细胞内信号转导活动改变。在感染晚期细胞凋亡机制被启动,凋亡蛋白通过26S蛋白酶体被降解。骨架蛋白TUBB、绒毛蛋白和微管交联因子等降低,细胞的骨架结构受到破坏。同时也启动了细胞骨架的维修活动。首次证明在感染宿主细胞内CCV的N蛋白有六种分子形式,可能分别执行不同的生物功能。