恶性肿瘤浸润生长和远处转移是晚期肿瘤的重要特征,近1/3的肿瘤患者首诊时已属晚期,40%的患者术后复发或转移,预后不良。筛选和鉴定肿瘤转移相关基因,建立一套转移生物学标志,用于早期发现肿瘤转移对降低肿瘤死亡率具有重要意义;而建立遗传背景相同的高、低转移细胞株是寻找和筛选转移相关基因的基础和关键。目的本研究通过3部分的实验:一、原位移植建立人肿瘤裸鼠转移模型;二、体内外连续筛选建立高转移人肿瘤细胞亚系;三、人肿瘤不同转移潜能单克隆细胞株的建立及其生物学特性,从中寻找和筛选转移相关基因,建立一套转移生物学标志,来用于早期发现肿瘤转移。方法一、原位移植建立人肿瘤裸鼠转移模型收集体外培养的对数生长期786-0细胞,进行裸鼠皮下注射,待皮下移植瘤长至直径为1.5cm左右时取出,以相同方法进行鼠间传代(每代2只),3～4代后取出移植瘤,剪成1mm3大小进行肾包膜下原位接种,获人肿瘤裸鼠转移模型,即外科原位移植(Surgical Orthotopic Implantation,SOI)模型,裸鼠垂死时脱颈处死,取出肺脏转移灶体外培养,胰酶消化传代4～5次后即获得较纯的肿瘤细胞,命名为786-0LM1。同时采用786-0细胞悬液进行肾包膜下原位注射,建立细胞原位注射(Cellular Orthotopic Injection,COI)模型,肺脏未见转移灶。二、体内外连续筛选建立高转移细胞亚系肿瘤转移异质性理论认为在肿瘤组织中存在着具有不同侵袭、转移能力的细胞亚群,而只有那些具有能完成侵袭转移全过程能力(黏附能力、蛋白水解能力、细胞游走能力)的瘤细胞才能最终形成转移灶。因此可依据某些侵袭、转移有关因素的表达与否筛选出具有不同侵袭转移能力的瘤细胞。Matrigel是一种从Engelborth-Holm-Swarm(EHS)小鼠肉瘤中提取的可溶性基底膜成分。主要由:层粘连蛋白、IV型胶原蛋白、硫酸乙酰肝素糖蛋白(类肝素蛋白多糖)、纤维连接蛋白、巢蛋白等组成。室温下Matrigel聚合成一种具有生物学活性的基质材料,在聚碳酯膜上形成一胶冻状物,封闭聚碳酯膜膜上的小孔,作用与哺乳动物细胞基底膜类似,只有那些具有蛋白水解能力的肿瘤细胞才能穿过Matrigel和聚碳酯膜上的小孔;无蛋白水解能力的非侵袭性细胞不能穿过,收集和扩增穿透侵袭膜背面以及掉到Transwell下室的细胞具有较强的侵袭性。因此Matrigel可用于体外分离侵袭性和非侵袭性肿瘤细胞。本研究应用Matrigel和Transwell Insert构建侵袭小室,基本过程是:Matrigel均匀铺在Transwell Insert的聚碳酯膜上(含8μm的小孔),下室加入趋化剂(无血清培养的NIH3T3上清),无血清1640悬浮的786-0LM1细胞105个/孔加入上室,37℃,5%CO2条件下孵育72小时后,收集穿过Matrigel的肿瘤细胞扩增培养,进行第二轮裸鼠体内筛选:裸鼠皮下接种细胞悬液,获得皮下移植瘤进行肾包膜下原位接种。如此重复共进行3轮体内外筛选。三、人肿瘤高、低转移克隆株的建立及其生物学特性本实验采用有限稀释法将高转移细胞亚系786-0LM3第10代细胞进行克隆化培养,并接种棵鼠筛选不同转移潜能的克隆株,发现第5(NO. 5)和第8(NO.8)克隆株转移能力差别最大,裸鼠肾包膜下接种瘤组织5周后,肺转移率分别为100%(10/10)和20%(2/10),分别命名为786-0H、786-0L。采用体外侵袭实验、染色体分析、软琼脂培养及裸鼠体内成瘤和转移实验研究发现:两细胞株的生物学特性明显不同。采用细胞免疫化学S-P法检测两细胞株表达肿瘤侵袭、转移相关的基因MMP-2、MMP-9、PCNA、NM23的差异。结果表明:786-0H表达MMP-2、MMP-9、PCNA均呈强阳性,786-0L呈弱阳性表达。结果一、SOI模型的成瘤率和转移率均高于COI模型。二、体外培养第3轮筛选获得的肺转移灶得到高系786-0LM3。三、两细胞株表达NM23无明显不同(均为阳性)。结论一、成功地建立了人肾透明细胞癌细胞系786-0裸鼠SOI模型,为探讨肾透明细胞癌的转移机制提供了良好的动物模型。二、证明了肿瘤的异质性不仅存在于肿瘤组织中而且存在于细胞系中;肿瘤的异质性是转移的根本原因,体内外连续筛选是分离转移细胞、优化转移模型的有效途径三、由于遗传背景相同,其转移表型的显著差异必然反映了转移相关基因结构或功能的差异,是mRNA差异显示技术克隆肿瘤转移相关基因,探讨肿瘤转移机制的理想材料。