植物细胞质雄性不育是由核基因和细胞质基因互作产生的一种花粉败育的生物学现象,是作物杂种优势的利用的基础。已有研究表明,线粒体基因组的异常对植物育性有直接影响,线粒体功能异常导致能量代谢失衡可引起花粉不育。NADH脱氢酶是线粒体呼吸链电子传递的主要入口,结构复杂,在糖酵解、糖异生、三羧酸循环中发挥着重要作用;并且对线粒体中ATP以及活性氧的产生起重要作用,而ATP供应不足以及活性氧积累会促进细胞凋亡从而导致花粉不育。本研究以棉花细胞质雄性不育系晋A、亚棉A及其各自的同核异质保持系为研究对象,克隆棉花Ghnad5的基因组DNA和cDNA,并进行RNA编辑分析;对其在小孢子不同发育时期的基因表达量和NADH脱氢酶活性进行测定;同时构建Ghnad5的RNAi和过量表达载体进行功能分析,旨在探讨Ghnad5基因与棉花细胞质雄性不育的关系。研究结果如下:1.采用同源克隆的方法,获得Ghnad5基因组DNA和cDNA序列。Ghnad5的两种不育系及其保持系中基因组DNA(包含启动子序列)全长均为3178 bp,cDNA序列均为1200 bp,编码399个氨基酸组成的肽链,预测的蛋白质分子量约为103 kDa。经氨基酸比对发现,四种材料均具有Proton antipo M保守结构域,并且两种不育系与其各自的保持系材料相比存在单个氨基酸残基的差异,但均未造成其关键功能结构域的改变。经生物信息学聚类分析发现,Ghnad5基因编码的蛋白与雷蒙德氏棉、中棉、拟南芥和大豆亲缘关系较近;而与烟草和水稻亲缘关系较远。对Ghnad5上游启动子序列分析表明,Ghnad5基因的表达水平可能主要响应于光照,生长素、赤霉素和茉莉酸甲酯等植物激素以及低温、干旱等逆境元素的变化。2.对克隆的晋A和亚棉A两种不育系及各自保持系的基因组DNA和cDNA序列进行RNA编辑分析,结果表明:保持系中Ghnad5基因未发生RNA编辑,JA-CMS和YMA-CMS中Ghnad5基因分别有两处发生RNA编辑。其中在YMA-CMS中从起始密码子开始的206 bp处的U→C的RNA编辑位点导致其第69位氨基酸由疏水性氨基酸变为亲水性氨基酸。推测,RNA编辑使YMA-CMS中nad5蛋白质亲水性的增强,可能与不育相关。3.采用实时荧光定量PCR,对Ghnad5基因在晋A和亚棉A两种不育系及各自保持系小孢子败育前、中、后3个时期花蕾中的相对表达量进行分析。结果表明:在小孢子败育前期,不育系晋A和亚棉A中Ghnad5基因的表达量均显著高于其同核异质保持系,而在败育时期及败育后时期,两种不育系材料Ghnad5基因的表达量均显著低于其保持系。由此推测,不育系材料在败育时期Ghnad5基因的表达量的降低可能影响电子传递链中的质子传递,从而导致ATP合成的减少;其表达量降低同样可导致电子逆向传递,从而产生超氧化物,使细胞内环境发生紊乱损伤细胞膜,引起细胞凋亡,导致花粉不育。4.对晋A和亚棉A不育系及其各自保持系小孢子发育过程中NADH脱氢酶活性进行测定。结果发现,在小孢子发育各时期,亚棉A中NADH脱氢酶活性极显著高于其保持系。晋A中NADH脱氢酶活性与其保持系相比差异较大,小孢子败育前期,晋A中NADH脱氢酶活性极显著高于其保持系,而小孢子败育和败育后时期其NADH脱氢酶活性低于保持系,分别达到极显著和显著性差异水平;并且发现晋A中NADH脱氢酶活性的变化与Ghnad5基因表达量的变化趋势相同。前期实验研究结果表明,在败育关键期,晋A中ROS含量增加,而在亚棉A则降低。在小孢子败育关键期,晋A不育系中Ghnad5基因下调表达,NADH脱氢酶活性降低,导致ROS积累,改变了线粒体内膜的通透性,导致细胞凋亡,从而影响小孢子的发育。而亚棉A不育系中Ghnad5基因的下调表达,但NADH脱氢酶活性升高,导致ROS含量降低。由此推测,NADH脱氢酶参与调控细胞中ROS的水平,进而影响小孢子的发育。5.构建了Ghnad5基因的RNAi表达载体以及过表达载体,为进一步Ghnad5基因的功能验证实验奠定基础。