假单胞菌是一类分布极其广泛的细菌。假单胞菌普遍具有较强的适应能力,这与其复杂的铁吸收系统有关。在荧光类假单胞菌中均可生产一种荧光多肽类铁载体pyoverdin,该物质是荧光类假单胞菌中最主要的铁吸收途径。另外一些荧光类假单胞菌也会生产其他铁载体,统称为次要铁载体。次要铁载体与铁离子的亲和度通常低于pyoverdin。2一些次要铁载体还具有其他功能,如结合其他金属离子,或是抗微生物活性。东湖假单胞菌(Pseudomonas donghuensis)是分离自东湖水样的一株假单胞菌,该菌株最大的特点是在MKB培养基中可以合成分泌大量的螯铁物质,其产螯铁物质能力要显著高于亲缘关系较近的荧光假单胞菌与恶臭假单胞菌。实验室前期研究工作表明东湖假单胞菌可以生产荧光铁载体pyoverdin与一种非荧光螯铁物质,其中非荧光螯铁物质对东湖假单胞菌培养物上清螯铁活性的贡献更大。然而对于该螯铁物质的其他特性仍不清楚。本论文对非荧光螯铁物质进行了进一步研究。非荧光螯铁物质的分离提取。紫外可见光光谱检测显示东湖假单胞菌的培养物上清在327与394nm左右有明显的吸收峰,当上清调至pH 3后这两处吸收峰会迁移至319与374 nm左右并伴随着峰高与峰形的变化。当pH=3的培养物上清被乙酸乙酯萃取后,剩余水相中这两处吸收峰高度都有显著的降低,同时水相中的螯铁活性会出现大幅度的下降。这些现象不同于荧光铁载体pyoverdin,表明东湖假单胞菌培养物上清螯铁活性的主要组成部分是一类可被乙酸乙酯萃取的非荧光螯铁物质。非荧光螯铁物质在pH 3与pH 7的条件下吸收峰与极性发生显著变化的现象暗示着该物质具有一定的酚类物质的性质。对东湖假单胞菌培养物上清中非荧光螯铁物质的分离方法选择了乙酸乙酯萃取的初步分离与Sephadex LH20柱层析分离。通过对分离条件的优化,在初步分离中确定了在中性与酸性条件下分别用乙酸乙酯萃取去除杂质的方法,以及在柱层析分离中选择了无水乙醇作为流动相。利用该分离方法最终可得到淡黄色的针状结晶,即为非荧光螯铁物质分离样品。高效液相色谱与气相色谱分析结果均表明非荧光螯铁物质分离样品中的物质组成十分单一,这说明可利用该分离方法从东湖假单胞菌培养物上清中有效的分离提取非荧光螯铁物质。东湖假单胞菌所产非荧光螯铁物质的分析鉴定。利用70eV与20eV的电子离子化质谱检测确定非荧光螯铁物质的分子量为138。核磁共振波谱检测结果显示溶于CD3OD的非荧光螯铁物质的氢谱中在7.163,7.442 ppm处有两个多重峰,碳谱中在122,130,162,170 ppm有四处信号,说明其分子中只含有位于芳香环上的两种不活泼氢原子与四种sp2杂化碳原子,如此简单的碳氢原子信号说明非荧光螯铁物质是一种对称的分子结构。根据红外吸收光谱检测结果发现非荧光螯铁物质在3235与1611cm-1处有吸收带,这说明其分子中含有羟基与羰基基团。综合这些检测结果可以初步推测非荧光螯铁物质的结构是7-羟基环庚三烯酚酮。另外,非荧光螯铁物质样品的元素分析结果(C,60.7-61.17%；H,5.017-5.155%；O,29.946-32.236%)与7-羟基环庚三烯酚酮物质的元素组成(C,60.87%；H,4.348%；O,34.78%)较相近。非荧光螯铁物质的紫外可见光光谱,电子离子化质谱,高效液相色谱分析,核磁共振氢谱与碳谱检测结果都与化学合成7-羟基环庚三烯酚酮标准品的相应检测结果具有极高的一致性。最后,非荧光螯铁物质的物理化学分析检测数据与7-羟基环庚三烯酚酮及其衍生物的相关报道具有对应性。所有这些证据都证实了非荧光螯铁物质的结构为7-羟基环庚三烯酚酮。7-羟基环庚三烯酚酮可与三价铁离子形成复合物。根据等摩尔系列法分析得出在pH=1.78的条件下7-羟基环庚三烯酚酮与三价铁离子的最大配位数为2：1,其复合物的稳定常数经计算约为109左右。7-羟基环庚三烯酚酮与铁离子对应于最大配位数的复合物呈现橙色,铁离子过量时则可能配位不完全,会形成紫色复合物。通过对7-羟基环庚三烯酚酮与铁离子混合物的萃取试验发现橙色复合物在酸性条件(pH=1.72)下可被乙酸乙酯萃取,而紫色复合物则停留在水相中,通过该方法可以得到7-羟基环庚三烯酚酮铁复合物及其镓复合物的制备样品。在电喷雾质谱检测中可以分别从7-羟基环庚三烯酚酮铁复合物及其镓复合物制备样品中检测到m/z=330与rn/z=343的离子,这两种离子可分别与7-羟基环庚三烯酚酮2：1铁复合物及其2：1镓复合物对应,这个结果证实了在复合物中7-羟基环庚三烯酚酮与铁离子或镓离子的配位数是2：1。核磁共振氢谱检测结果显示溶于CDCl3的7-羟基环庚三烯酚酮镓复合物制备样品在7.19与7.39 ppm处有两处三重峰,在7.19与7.39 ppm处有两处二重峰,这说明在复合物中7-羟基环庚三烯酚酮的对称性被打破,可以推断7-羟基环庚三烯酚酮与金属离子的结合位点是分子上的羰基与其中一个邻位羟基。东湖假单胞菌可利用7-羟基环庚三烯酚酮作为自身的铁载体。首先,东湖假单胞菌会根据培养基中的亚铁离子浓度对7-羟基环庚三烯酚酮的生产进行调控,8μmol·L-1亚铁离子即可抑制其产生；其次,东湖假单胞菌缺陷株ApvdA可以吸收7-羟基环庚三烯酚酮铁复合物,而且缺陷株对铁复合物的吸收要略强于自由铁离子；最后,东湖假单胞菌双缺陷菌株ml 6△pvdA在铁限制培养基中的生长受限状况可通过外源补加足量7-羟基环庚三烯酚酮来缓解。但是,在同样的铁限制培养基中东湖假单胞菌只产pyoverdin的缺陷株m16明显的比只产7-羟基环庚三烯酚酮的缺陷株△pvdA生长状态更好,说明在东湖假单胞菌中pyoverdin是作为主要铁载体,而7-羟基环庚三烯酚酮则作为次要铁载体起作用。在东湖假单胞菌中pyoverdin与7-羟基环庚三烯酚酮均可作为铁载体利用,但两者在合成时期,对铁的敏感度和对铁离子的亲和度等方面都具有显著不同。推测东湖假单胞菌利用这两种铁载体分别应对不同的环境条件,7-羟基环庚三烯酚酮主要用于应对铁限制条件较轻的环境,而pyoverdin则用于对抗极端铁限制环境。总而言之,本研究鉴定出东湖假单胞菌所生产的非荧光螯铁物质的结构是7-羟基环庚三烯酚酮,解析了7-羟基环庚三烯酚酮与三价铁离子的配合形式,并确定了7-羟基环庚三烯酚酮在东湖假单胞菌中的铁载体功能。本研究的意义在于揭示了7-羟基环庚三烯酚酮未曾报道的作为荧光类假单胞菌次要铁载体的生物功能,并分析了东湖假单胞菌利用7-羟基环庚三烯酚酮与pyoverdin这两种铁载体所应对的不同铁限制条件。本研究为假单胞菌中多种铁载体协同作用的机制方面提供新的认识。