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目的:建立自身免疫性肝炎(Autoimmune Hepatitis,AIH)小鼠模型,研究Treg/Th17细胞异常在AIH发病中的调控作用及“补虚化瘀”方药治疗AIH的作用机制。
方法:雄性4-6周龄C57/BL6小鼠60只,随机分为空白组、模型组、西药组和补虚化瘀法组方的中药低剂量组、中剂量组、高剂量组(每组10只)。各药物干预组预先给药7天,其中西药组以强的松灌胃(0.1mg/只/天),中药组分别以人每天所需生药量的10、20、40倍灌胃,模型组、空白组予等体积生理盐水灌胃,灌胃1次/天,第7天灌胃8h后各药物干预组采用α半乳糖酰基鞘氨醇(α-Galcer)腹腔注射(2ug/10g)造模,造模10~12小时后眼球采血取组织,分别检测各组的肝功能、病理改变情况;流式细胞技术检测各组肝组织中Treg(CD4+CD25+Foxp3+)细胞及Th17(CD3+CD4+IL-17+IFN-γ-)细胞的数量;ELISA法检测各组肝组织中Treg、Th17细胞相关细胞因子的表达(TGF-β1、IL-10、IL-17);实时荧光定量PCR(Real-timeQPCR)、Western-blot技术检测肝脏中两种特异性转录因子Foxp3、ROR-γtmRNA及蛋白的表达。
结果:
1.小鼠肝脏病理:经α-Galcer造模后,C57BL/6小鼠表现出不同程度的肝损害,病理显示为1~2级即轻到中度的界面性炎症,门管区及周围存有明显炎性细胞浸润;与模型组比较,西药组和中药组肝损害程度较轻,且炎性细胞浸润缓解;空白组肝组织结构基本正常。
2.小鼠肝功能情况:经α-Galcer造模后,空白组以外的其他各组肝功能指标ALT、AST、AKP均有不同程度的升高;各组ALT、AST表达水平模型组>中药低剂量组>西药组>中药中剂量组>中药高剂量组>空白组;AKP指标模型组>中药低剂量组>中药中剂量组>西药组>中药高剂量组>空白组;与模型组比较,各组均具有统计学差异(P<0.05);但中西药组以及中药各剂量组间差异无统计学意义(P>0.05),且中药呈现出剂量依赖趋势。
3.小鼠肝细胞Treg、Th17细胞含量检测结果:流式细胞检测结果显示肝组织淋巴细胞中Treg(CD4+CD25+Foxp3+)细胞数量模型组<中药低剂量组<中药中剂量组<西药组<中药高剂量组<空白组;Th17(CD3+CD4+IL-17+IFN-γ-)细胞数量模型组>中药低剂量组>西药组>中药中剂量组>中药高剂量组>空白组;与模型组相比,各组均具有统计学差异(P<0.05,P<0.01)。Treg/Th17细胞比值模型组<中药低剂量组<中药中剂量组<西药组<中药高剂量组<空白组;与模型组比较,各组均有统计学差异(P<0.05);但中药组与西药组之间以及中药各剂量组之间差异均不明显(P>0.05),且中药治疗组有剂量依赖趋势。
4.小鼠肝组织中Treg、Th17细胞相关细胞因子(TGF-β1、IL-10、IL-17)的表达结果:ELISA检测示肝组织TGF-β1水平模型组>西药组>中药低剂量组>中药高剂量组>中药中剂量组>空白组,各治疗组与模型组比较无统计学差异(P>0.05);IL-10检测结果模型组<中药低剂量组<中药中剂量组<西药组<中药高剂量组<空白组,各组与模型组比较,差异均有统计学意义(P<0.05);IL-17检测结果模型组>中药低剂量组>中药中剂量组>西药组>中药高剂量组>空白组,各组与模型组比较,差异均有统计学意义(P<0.05);但中西药组及中药各剂量组之间无差异(P>0.05)。
5.肝脏转录因子Foxp3、RORγtmRNA的表达结果:RT-PCR产物凝胶电泳成像显示逆转录成功;Real-timeRT-PCR分析结果显示各组肝组织转录因子Foxp3mRNA水平模型组<中药低剂量组<西药组<中药中剂量组<中药高剂量组<空白组,模型组与空白组比较差异有统计学意义(P<0.05),但与其他各治疗组比较无明显差异(P>0.05);RORγtmRNA水平模型组>西药组>中药低剂量组>中药中剂量组>中药高剂量组>空白组,各组与模型组相比均具有统计学差异(P<0.05),中药中剂量组和高剂量组表达降低明显,有显著统计学差异(P<0.01)。
6.肝脏转录因子Foxp3、RORγt蛋白的表达结果:各组肝脏WesternBlot检测结果Foxp3蛋白表达模型组<西药组<中药高剂量组<中药低剂量组<中药中剂量组<空白组,各组与模型组分别比较均具有统计学差异(P<0.05),中药各剂量组升高明显,有显著差异(P<0.01);RORγt蛋白表达模型组>中药高剂量组>西药组>中药低剂量组>空白组>中药中剂量组,各组与模型组比较均具有显著统计学差异(P<0.01)。
结论:
1.“补虚化瘀法”组方中药可有效改善AIH模型小鼠肝功能,降低模型小鼠血清ALT、AST及AKP指标,缓解肝组织炎症,具有与激素类似的效果。
2.AIH模型小鼠肝组织淋巴细胞中Treg细胞水平明显降低,而Th17细胞增加,Treg/Th17比值也显著下降,不同剂量“补虚化瘀法”组方中药可增加AIH小鼠肝组织淋巴细胞中Treg比例,降低Th17比例,从而调节Treg/Th17细胞平衡紊乱,达到免疫调节作用。
3.TGF-β1、IL-10、IL-17是影响Treg、Th17细胞分化增殖的细胞因子。IL-10、IL-17分别促进Treg、Th17增殖,TGF-β1对二者均有促进作用。不同剂量“补虚化瘀法”组方中药可增加肝组织内IL-10含量,降低肝组织内IL-17含量,从而调节Treg/Th17细胞平衡。
4.“补虚化瘀法”各治疗组可显著降低AIH小鼠肝组织RORγtmRNA含量,从而影响RORγt蛋白的表达抑制Th17细胞发育和增殖,而对Foxp3mRNA的调控未发现明显作用,有待于进一步研究。
5.Foxp3、RORγt分别是Treg、Th17细胞特异性转录因子,是二者发育和产生功能效应的主要因素。“补虚化瘀法”各治疗组可显著提高肝组织Foxp3表达,降低RORγt表达,从而调节Treg、Th17细胞发育和增殖,从而对恢复Treg/Th17细胞平衡起到调节作用。