论文部分内容阅读
腺相关病毒(adeno-associatedvirus，AAV)是基因治疗中最为有效且应用广泛的载体之一。AAV的细胞内转运过程是其在多种细胞和组织中转导效率不足的主要限制性屏障。内体的成熟及其与溶酶体的融合是自噬体形成的重要机制。而AAV感染后进入细胞内吞小体后的酸化过程也被认为既是其通过溶酶体降解，也是其从内体内逃逸的必经步骤。研究表明氯化铵(NH4Cl)作为一种自噬抑制剂处理细胞后能抑制内体的酸化而抑制AAV的转导效率。我们发现自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3MA)处理U87-MG细胞后引起AAV转导抑制的同时伴随自噬相关蛋白p62/SQSTM1的显著上调，而利用红外荧光标记AAV感染细胞后出现p62与AAV的共定位现象，提示AAV的细胞内转运和对细胞的转导可能受到p62的影响。在U87MG细胞中过表达p62能够抑制AAV介导的基因表达，而靶向p62的siRNA转染则可以增加AAV的转导。进一步的研究表明，转染p62泛素化蛋白结合域UBA缺失的突变体，AAV转导细胞的效率未见显著影响。蛋白酶体抑制剂MG132处理U87-MG细胞，能够增加AAV的转导，而p62的过表达能减弱其增强效应，但UBA缺失的p62则不具有这种效应。我们的研究不仅发现了一种通过RNA干扰技术增加AAV转导效率的有效手段，同时也为深入探讨AAV细胞内转运以及蛋白酶体抑制剂增加AAV转导机制的研究提供了有价值的提示和线索。 结论: 1.AAV与p62具有细胞内共定位现象。NH4Cl及3MA抑制AAV转导的同时出现p62蛋白水平的上调。提示自噬相关蛋白p62可能作用于AAV的细胞转运和转导过程。 2.过表达野生型p62能够抑制AAV的转导，而p62的RNA干扰则可以增加AAV的转导效率。表明对p62的抑制可能是增加AAV转导的有效手段。 3.过表达p62的UBA功能缺失突变体，对AAV的转导没有显著的抑制效应。表明p62的泛素化蛋白结合能力可能是其介导AAV转导抑制的作用机制。 4.蛋白酶体抑制剂MG132增加AAV转导与病毒衣壳蛋白的泛素化相关。过表达p62对MG132作用的削弱以及p62的UBA缺失突变的非抑制性表现，提示细胞自噬作用对AAV转导的调节与AAV衣壳蛋白的泛素化相关密切相关。