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肢端发育是脊椎动物最复杂最精妙的调控过程之一,寻找及研究肢端发育相关基因,一直是发育生物学中的热点研究。在人类中,LRP4突变会导致三种单基因疾病,包括:CLS型并指症;先天性肌无力症和二型硬化性骨病。其中CLS型并指症是一种严重的肢端发育异常疾病。在小鼠中,各种Lrp4缺陷型小鼠也大多存在着并指等肢端发育异常表型。但关于LRP4是如何参与肢端调控的内在分子机制仍然不清楚,本研究结合体内外实验发现LRP4通过串联经典WNT和BMP两条信号通路,参与并维持肢端骨骼正常发育。通过siRNA干扰实验在人成骨细胞系hFOB细胞中敲低LRP4,当敲低效率接近70%时,qPCR检测发现经典WNT信号通路表达显著上调,BMP信号通路表达显著上调,成骨标志基因表达上调。通双荧光素酶实验发现过表达Lrp4会拮抗经典Wnt信号和Bmp信号。通过慢病毒介导在小鼠成骨细胞系MC3T3-E1细胞中构建稳定过表达Lrp4的稳转细胞株,经过qPCR和Western blotting验证,证实该稳转细胞系构建成功。在Lrp4过表达稳转MC3T3-E1细胞中,发现在转录水平经典Wnt信号通路和Bmp信号通路显著下调,双荧光素酶实验进一步揭示,稳定过表达Lrp4后会导致Wnt信号和Bmp信号显著下调,并且成骨标志基因表达明显下调。在小鼠胚胎干细胞ES17中,通过CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除Lrp4,经过筛选得到一株在2号外显子缺失88bp的单克隆细胞株Lrp4-/-,缺失88bp会造成移码突变提前产生终止密码子,产生一个366AA的功能缺失截短蛋白。经过验证,发现Lrp4功能缺失造成经典Wnt信号通路和Bmp信号通路显著上调,双荧光素酶分析后发现经典Wnt信号和Bmp信号均显著上调。为进一步了解LRP4的功能,使用转录组分析,经过GO和KEGG初步分析数据,检测到Lrp4敲除细胞与ES17细胞相比存在1989个差异表达基因,Lrp4敲除后上调930个基因,下调1059个基因。使用Morpholino技术敲低斑马鱼lrp4基因后,morphants表型部分模拟小鼠和人类LRP4缺陷后表型和症状。进一步体内验证,在敲低lrp4的斑马鱼中,qPCR检测发现经典Wnt信号通路和Bmp信号通路上调。通过使用体内双荧光素酶实验检测发现,经典Wnt信号和Bmp信号显著上调。体内实验和体外实验得出的结论一致,LRP4串联并拮抗经典Wnt和Bmp两条信号通路。CLS并指（趾）症为常染色体隐性遗传疾病,而LRP4的功能缺失是造成CLS并指（趾）症的主要原因。我们构建Lrp4 CLS点突变,过表达Lrp4野生型和一系列CLS点突变,通过使用体外双荧光素酶实验检测发现CLS点突变可部分失去拮抗经典Wnt信号和Bmp信号通路的能力。综上所述,经过一系列siRNA干扰敲低、构建Lrp4过表达稳转细胞系、CRISPR/Cas9基因编辑以及斑马鱼体内敲低等实验,首次筛选到LRP4介导的新的信号通路Bmp信号通路,并证明LRP4很可能通过串联并拮抗经典Wnt和Bmp两条信号通路,调节成骨基因参与肢端骨骼发育进程。