第一部分背景和目的:点阵激光、微针辅助药物透皮技术近年来已广泛用于疾病治疗、疫苗免疫、疾病检测、美容等各种领域。点阵激光、微针通过对皮肤的可逆性消融或破坏,增加药物的经皮吸收并渗透更深,是一种可控的辅助透皮给药系统。本研究使用点阵Er:YAG激光、固体微针辅助环孢素纳米粒透皮治疗5%咪喹莫特诱导的银屑病样皮炎小鼠模型,探讨环孢素这一系统性治疗药物在皮肤科常见医疗器械的辅助下,局部应用治疗银屑病样皮炎模型小鼠的疗效与机制。方法:1.通过化学方法合成环孢素纳米粒胶束,并对其理化性质进行表征、评估其稳定性。体外培养HeCaT及成纤维细胞,用不同浓度的环孢素纳米粒干预48小时后行CCK检测药物细胞毒性。使用点阵Er:YAG激光、固体微针作为辅助透皮手段,用共聚焦荧光显微镜观察脂溶性荧光在离体猪皮上的体外透皮效应。2.连续5天给小鼠右耳涂抹5%咪喹莫特诱导形成银屑病样皮炎小鼠模型,造模成功后第6天开始连续三天用固体微针扎入右耳皮肤后,外用涂抹三个不同浓度的环孢素纳米粒（0.4 mg/mL、2 mg/mL、10 mg/mL）,第9天取血清测量肝肾功能评估安全性,取右耳皮肤组织病理切片观察表皮厚度的变化。在第6天时使用点阵Er:YAG激光、固体微针处理模型小鼠和正常小鼠耳部皮肤后取材做病理切片观察在皮肤中留下的微孔道。3.选择浓度为2 mg/mL环孢素纳米粒作为外用药物,在点阵Er:YAG激光、固体微针辅助透皮下治疗银屑病样皮炎小鼠模型。用药3天后第4天取血清测量肝肾功能、取肝肾做病理切片评估安全性。使用游标卡尺测量皮肤厚度、评估PASI评分、测量病理切片表皮厚度来评估疗效。使用免疫组化方法观察右耳皮肤组织内PCNA、iNOS、VEGF、Ki67、CD3水平。使用ELISA试剂盒检测血清IL-2、IL-17、TNF-α、IL-22、IL-23的分泌水平。使用PCR技术检测IL-23、IL-17A、IL-17C、IL-17F、IL-22。使用W-B检测JAK3、p-JAK3、STAT3、p-STAT3、IFN-γ、SOCS3蛋白水平。结果:1.成功合成了环孢素纳米粒胶束,其粒径为187±12.6 nm,浓度为（0.4mg/mL、2 mg/mL、10 mg/mL）,其中0.4 mg/mL与2 mg/mL稳定性良好,10 mg/mL稳定性较差。通过CCK检测药物细胞毒性观察到当药物浓度小于1μg/mL时对HeCaT及成纤维细胞无明显毒性,当药物浓度达到10μg/mL以上时,显著抑制了两种细胞的增殖水平,对细胞产生了毒性。通过共聚焦荧光显微镜在离体猪皮上观察到微针与点阵激光形成的微孔道,脂溶性荧光剂在该孔道周边蓄积,微针组荧光深度可达210μm,点阵激光组荧光深度可达230μm。2.在固体微针辅助透皮的作用下,与对照组相比,外用浓度为2 mg/mL、10 mg/mL的环孢素纳米粒组第9天均观察到银屑病样皮炎小鼠模型表皮厚度变薄;浓度0.4 mg/mL的环孢素纳米粒组第9天未观察到银屑病样皮炎小鼠模型表皮厚度变薄,三组小鼠肝肾功能均为正常值。正常小鼠、模型小鼠右耳皮肤在经过点阵激光、固体微针处理后的病理切片中,均可观察到点阵激光、固体微针形成的微孔道。3.游标卡尺测量右耳皮肤厚度、病理切片通过Image J测量表皮厚度均观察到微针+环孢素纳米粒外用组、激光+环孢素纳米粒外用组皮肤增厚情况较模型组较少。对耳部皮损处鳞屑、红斑、皮肤增厚情况进行PASI评分也反映微针+环孢素纳米粒外用组、激光+环孢素纳米粒外用组疗效较好。安全性评估中这两组联合用药组未见明显肝肾损害。免疫组化实验观察到两组联合用药组PCNA、iNOS、VEGF、ki67、CD3+淋巴细胞水平较模型组降低。ELISA试剂盒检测血清IL-2、IL-17、IL-22、IL-23、TNF-α的分泌水平较模型组降低。W-B检测观察到两组联合用药组较模型组耳部皮损组织IFN-γ、p-JAK3、p-STAT3蛋白水平降低,SOCS3蛋白水平升高。PCR检测观察到两组联合用药组小鼠皮损组织中IL-17A、IL-17C、IL-22、IL-23、IL-17F的分泌水平较模型组降低。结论:本研究成功合成了环孢素纳米粒并验证其稳定性与安全性。创新地将固体微针、点阵Er:YAG激光透皮给药技术与纳米技术有机结合,验证了这种联合给药技术可以有效辅助大分子脂溶性药物环孢素实现安全、有效、可控的透皮给药,并有效缓解了5%咪喹莫特乳膏诱导形成的小鼠银屑病样皮炎。从皮肤厚度、PASI评分、表皮厚度、免疫组化、ELISA、W-B、PCR检测均观察到联合用药组对银屑病样皮炎小鼠模型疗效更好。本研究将皮肤科中治疗中重度银屑病的系统性药物环孢素,通过联合透皮技术成功的局部外用治疗银屑病模型,为炎症性皮肤病外用药治疗提供了新的理论和实践依据。第二部分背景和目的:狼疮带试验是使用直接免疫荧光法检测狼疮患者皮肤真表皮交界处免疫球蛋白及补体沉积的方法,是诊断狼疮的重要辅助检查之一。但因狼疮皮损多位于面部,而狼疮带试验是一种有创的诊断方法,所以严重影响了其使用率。在本研究中,我们选择点阵Er:YAG激光这种在前期研究已经验证其具有创伤小、修复快、可控性好等优点的透皮给药系统,辅助分子量约150 KDa的水溶性荧光抗体进行透皮诊断。在前期研究的基础上,本研究在MRL/lpr狼疮小鼠上进行在体狼疮带试验,拟实现一种新型、无创的在体狼疮带试验。方法:1.使用H＆E染色组织病理切片观察MRL/lpr小鼠是否具有与红斑狼疮类似的病理特点。将14周雌性MRL/lpr小鼠作为模型,取皮损周围正常皮肤进行传统的离体狼疮带试验,将MRL/lpr小鼠皮肤冰冻切片与T-IgG及FITC-羊抗小鼠IgG共同孵育30分钟,使用免疫荧光显微镜观察MRL/lpr小鼠皮肤基底膜带IgG的沉积,以验证狼疮带的存在,然后将切片进行H＆E染色进一步确定荧光带位置。2.选择皮损明显的14周雌性MRL/lpr小鼠作为试验组,14周雌性MRL/MpJ小鼠作为阴性对照组。小鼠脱毛后使用点阵激光处理皮损及周围皮肤,参数为12.5 J/cm~2和210孔/cm~2,外涂T-IgG透皮24小时后取皮损周围正常皮肤,一部分进行冰冻切片后使用荧光显微镜观察基底膜带附近是否有带状荧光存在,并进行H＆E染色进一步确定荧光带位置;另一部分MRL/lpr小鼠皮肤使用共聚焦显微镜分层扫描观察荧光分布强度、深度。结果:1.MRL/lpr狼疮小鼠皮损处皮肤组织病理切片具有与人狼疮皮损类似的病理特征。取小鼠皮损周围皮肤,进行冰冻切片后进行狼疮带试验,即阳性对照试验。观察到真表皮交界处明显带状荧光,说明MRL/lpr狼疮小鼠皮肤基底膜带存在IgG沉积,并能与T-IgG结合,验证了MRL/lpr狼疮小鼠可以作为理想的狼疮带试验模型。2.在体狼疮带试验中,MRL/lpr狼疮小鼠皮肤冰冻切片后荧光显微镜下可观察到真表皮交界处明显红色带状荧光,即狼疮带试验阳性。将该冰冻切片进行H＆E染色,通过对比可更清晰地观察荧光位置位于真表皮交界处,而没有使用激光透皮的空白对照组没有观察到荧光,MRL/Mp J小鼠阴性对照组在皮肤中仅显示少数微弱的荧光信号,LBT呈阴性。共聚焦显微镜显示,当MRL/lpr小鼠皮肤的扫描深度为60-80μm时,空间扩散荧光信号最强,对应于基底膜带的位置。同时共聚焦分层扫描荧光图中荧光分布深度为0-150μm,其中深度为60-80μm（真表皮交界处）时荧光最强,且微孔间可观察到明显荧光弥散。结论:本研究成功验证了MRL/lpr狼疮小鼠是一种理想的狼疮带试验模型。创新性地使用点阵Er:YAG激光作为透皮给药系统在此狼疮鼠模型上实现了在体狼疮带试验,为狼疮的无创诊断、其他皮肤疾病的诊断以及靶向治疗提供了新的方法和途径。结合第一、第二部分的研究,本论文成功的验证了点阵激光及固体微针是两种良好的新型透皮给药系统,它们处理皮肤后在皮肤上形成的微孔道,可增加大分子药物、抗体等物质的透皮效率,达到透皮给药治疗、透皮免疫的效果,为银屑病、红斑狼疮等炎症性皮肤的诊断与治疗提供了新的思路与理论基础。