糖尿病肾病（DN）是糖尿病最常见、最严重的微血管并发症之一,而目前尚无有效治疗方案。DN发病机制复杂,尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4（NOX4）异常激活在DN发生发展中起关键作用。研究证实维生素D在改善DN中发挥重要作用,但维生素D能否抑制糖尿病状态下肾脏NOX4的异常激活及其潜在机制不明,深入进行相关研究将为维生素D防治DN提供科学依据。第一部分1,25（OH）2D3对自发性糖尿病大鼠糖脂代谢紊乱的改善作用目的:探究维生素D缺乏的自发性糖尿病大鼠糖脂代谢水平及1,25（OH）2D3的干预效应。方法:40只雄性Zucker糖尿病肥胖大鼠随机分为4组,即糖尿病组（ZDF）、1,25（OH）2D3低剂量干预组（ZDF+VL,2μg/kg.bw）、中剂量干预组（ZDF+VM,8μg/kg.bw）和高剂量干预组（ZDF+VH,16μg/kg.bw）。此外,10只性别年龄相匹配的Zucker瘦型（ZL）大鼠作为对照组。给予维生素D缺乏Purina#5008饲料,干预7周。监测大鼠体重、进食量、饮水量、尿量和尿糖现象,计算能量摄入量和能量利用率;检测大鼠尿糖、血糖、血清胰岛素水平,计算胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）和胰岛β细胞功能指数（HOMA-β）;干预结束前一周行葡萄糖耐量（OGTT）和胰岛素耐量（ITT）试验;测定血清甘油三酯（TG）、胆固醇（TC、HDL-C、LDL-C）、脂联素水平及钙磷代谢相关指标。结果:1.体重、“三多症状”:与ZL组比,ZDF组大鼠体重、进食量、饮水量和尿量显著增加（P＜0.05）,1,25（OH）2D3干预组以上指标均明显降低（P＜0.05）,且呈剂量依赖效应。2.糖代谢:ZDF组大鼠尿糖、血糖、血清胰岛素水平、HOMA-IR值、OGTT和ITT曲线下面积均明显高于ZL组（P＜0.05）。1,25（OH）2D3干预后,尿糖、血糖、HOMA-IR值、OGTT和ITT曲线下面积下降,而HOMA-β值升高（P＜0.05）,尤其是中、高剂量组的改善作用显著。3.脂代谢:与ZL组比,ZDF组大鼠血清TG、TC、LDL-C水平分别升高297%、48%和50%,脂联素水平降低26%（P＜0.05）。ZDF+VM与ZDF+VH组大鼠血清TG水平较ZDF组分别降低37%和48%,脂联素水平分别升高47%和68%（P＜0.05）。4.钙磷代谢:ZDF组大鼠血钙水平较ZL组显著增加（P＜0.05）。1,25（OH）2D3干预后,血清1,25（OH）2D3水平基本与外源性补充剂量呈正相关,尤其是在高剂量组（P＜0.05）。结论:1,25（OH）2D3干预显著降低维生素D缺乏的ZDF大鼠体重,改善糖尿病“三多”症状、糖代谢紊乱和以TG升高为主的脂代谢紊乱。第二部分1,25（OH）2D3对自发性糖尿病大鼠肾脏损伤的保护效应目的:从肾功能、肾脏组织结构及肾脏氧化损伤、炎症、纤维化等不同层面明确1,25（OH）2D3对自发性糖尿病大鼠肾脏损伤的保护作用。方法:ZDF大鼠的饲养、分组及干预同第一部分。采用ICP-MS方法检测大鼠尿液微量元素排泄量;检测大鼠尿微量白蛋白（MALB）、尿肌酐浓度,并计算尿微量白蛋白与肌酐比值（UACR）;测定血肌酐和血尿素氮（BUN）浓度;HE染色、透射电镜分别观察肾脏组织形态学改变和肾小球基底膜厚度（GBM）、足突融合;PAS染色观察肾小球和肾小管病理改变;DHE探针评估大鼠肾脏ROS水平,并检测肾脏组织MDA和GSH水平;采用蛋白免疫印迹和免疫组化方法检测肾脏氧化损伤、炎症、纤维化蛋白的表达;Masson染色观察肾脏组织纤维化程度。结果:1.尿液微量元素代谢:与ZL组相比,ZDF组大鼠尿液微量元素排泄量明显增加,1,25（OH）2D3干预后可明显降低尿铜（Cu）、锌（Zn）、硒（Se）及钼（Mo）水平,且中、高剂量组的改善效果明显。2.肾脏脏体比及肾功能:与ZL组相比,ZDF组大鼠肾脏脏体比、血肌酐浓度明显升高（P＜0.05）。1,25（OH）2D3干预组呈剂量依赖性降低肾脏脏体比（P＜0.05）,且血肌酐水平呈下降趋势。ZDF组MALB含量、UACR及尿肌酐含量较ZL组显著升高,1,25（OH）2D3干预后呈剂量依赖性逆转了上述变化（P＜0.05）。3.肾脏组织形态学和病理改变:相较于ZL组,ZDF组大鼠肾小球直径和面积异常增大,GBM厚度增加、足突融合或消失,肾小球系膜区面积增大和肾小管扩张（P＜0.05）。1,25（OH）2D3干预后不同程度地改善肾脏组织形态学改变和病理损伤。4.肾脏氧化损伤、炎症、纤维化:与ZL组比,ZDF组大鼠肾脏MDA、ROS水平以及4-HNE、8-OHd G蛋白水平增加,GSH水平降低（P＜0.05）;1,25（OH）2D3干预明显降低上述氧化损伤指标和标志物蛋白水平并增加GSH含量（P＜0.05）。ZDF组大鼠肾脏NFκB、TNFα、IL-6、IL-18、IL-33的表达量明显高于ZL组,1,25（OH）2D3干预后可使之呈现不同程度的降低,尤其是中、高剂量组（P＜0.05）。相反,1,25（OH）2D3干预后IκBα的表达水平较ZDF组相比呈增加趋势,且ZDF+VH组最为明显（P＜0.05）。ZDF组大鼠肾脏TGF-β、collagenⅣ、Fibronectin表达量较ZL组升高,ZDF+VL组可部分逆转ZDF大鼠肾脏纤维化蛋白的高表达（P＜0.05）;Masson染色结果基本与各组间肾脏纤维化蛋白的检测结果相一致。结论:1,25（OH）2D3对自发性糖尿病大鼠具有肾脏保护作用,主要表现为改善以铜、锌、硒、钼为主的尿液微量元素代谢紊乱,改善ZDF大鼠肾功能,恢复肾脏组织形态及病理结构改变,逆转肾脏氧化损伤及炎症反应。第三部分NOX4在糖尿病肾脏氧化损伤中的作用及1,25（OH）2D3的干预机制研究目的:以NOX4为核心,探讨1,25（OH）2D3减轻自发性糖尿病大鼠肾脏氧化损伤的潜在机制。方法:动物实验:ZDF大鼠的饲养、分组及干预同第一部分,采用蛋白免疫印迹方法检测肾脏氧化通路相关蛋白（VDR、PARP1、SIRT1、NOX4、p22、gp91、HO-1、SOD2、CAT）表达水平;采用免疫组化方法观察肾脏氧化通路关键蛋白（PARP1、SIRT1、NOX4）分布情况。细胞实验:高糖、甘露醇、1,25（OH）2D3、PARP1抑制剂、NOX4抑制剂、SIRT1激活剂与抑制剂单独或联合孵育人肾皮质近曲小管上皮（HK-2）细胞48 h。Western blot检测SOD2、CAT或VDR及氧化通路蛋白表达的变化情况,DCFH-DA荧光探针评估细胞ROS水平。结果:1.1,25（OH）2D3改善自发性糖尿病大鼠肾脏氧化损伤可能与PARP1/SIRT1/NOX4通路有关与ZL组比,ZDF组大鼠肾脏VDR、SIRT1、HO-1、SOD2、CAT低表达,PARP1、NOX4、p22、gp91高表达。1,25（OH）2D3干预组明显逆转除gp91以外的上述蛋白表达水平（P＜0.05）。免疫组化结果显示氧化通路关键蛋白表达主要分布于肾小管周围。2.1,25（OH）2D3通过调控SIRT1/NOX4通路改善高糖诱导HK-2细胞氧化损伤2.1 PARP1、NOX4在高糖诱导HK-2细胞氧化应激中作用及1,25（OH）2D3保护效应:与高糖孵育HK-2细胞相比,PARP1抑制剂（Olaparib）或NOX4抑制剂（GKT137831）均可降低细胞ROS水平（P＜0.05）;而1,25（OH）2D3可显著增加VDR、SIRT1及HO-1、SOD2、CAT抗氧化蛋白的表达,降低PARP1、NOX4的表达,抑制高糖诱导细胞内ROS的过量产生（P＜0.05）。2.2 SIRT1对NOX4的调控作用及1,25（OH）2D3在高糖致HK-2细胞氧化损伤中的干预机制:与对照组相比,SIRT1抑制剂（Ex527）组可呈剂量依赖性增加NOX4、降低SOD2的表达。相反,SIRT1激活剂（SRT1720）组可呈剂量依赖性降低NOX4、增加SOD2的表达。此外,与HG+1,25（OH）2D3组相比,HG+1,25（OH）2D3+Ex527组明显阻断1,25（OH）2D3对NOX4的有效抑制及对抗氧化蛋白的增强作用（P＜0.05）。结论:1,25（OH）2D3可能通过PARP1/SIRT1/NOX4通路缓解自发性糖尿病大鼠肾脏及高糖诱导HK-2细胞氧化损伤;NOX4的异常激活依赖SIRT1的调控,1,25（OH）2D3通过上调SIRT1水平进而降低NOX4表达,减轻糖尿病肾脏氧化损伤。