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肺纤维化是多种肺部疾病或损伤发展到晚期的一种常见的病理变化,其特征是肺成纤维细胞增殖和细胞外基质大量沉积。约半数以上的肺纤维化患者为原因不明的特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)。目前,对于IPF尚无特异有效的临床治疗药物。本实验的目的是利用BLM诱导的肺纤维化大鼠动物模型和体外培养的肺成纤维细胞评价DS1对肺纤维化的影响,探讨了DS1对肺部炎症损伤、细胞损伤、缺氧损伤和纤维化的影响,并使用体外缺氧模型深入研究了DS1对缺氧诱导的缺氧诱导因子(hypoxia-inducible factor,HIF)-1α的调节作用以及与纤维化的关系。
本研究第一部分:建立BLM致肺纤维化的动物模型和体外肺成纤维细胞模型,评价中药有效成分DS1的抗纤维化作用。体内实验以地塞米松为治疗对照药,通过检测肺羟脯氨酸含量和病理组织学检查(包括镜下观察、肺泡炎和纤维化半定量评分,及胶原纤维面积图像分析)的方法评价DS1(2.5,5mg/kg/day)对BLM引起的SD大鼠肺纤维化的影响;体外试验利用人胚胎肺成纤维细胞(WI-38)和原代培养大鼠肺成纤维细胞评价DS1对细胞增殖和胶原合成的影响。结果显示,给予DS1和地塞米松可明显减少BLM诱导的大鼠肺组织中羟脯氨酸含量的增高,并降低肺纤维化分值和肺纤维化面积百分比。另外,给予DS1和地塞米松可显著改善由BLM引起的其他指标改变,如肺湿重和相对重量的增加、肺泡炎分值的增高。综合各检测指标结果可见,DS15mg/kg/day的综合疗效优于地塞米松(0.5mg/kg)。体外试验表明DS1(100~10ug/ml)显著抑制TGF-β1刺激的WI-38细胞胶原合成增加;并明显抑制10%胎牛血清诱导的WI-38细胞和原代培养的大鼠肺成纤维细胞的细胞增殖。
本研究的第二部分:考察DS1对抗BLM致肺纤维化时效关系和作用机制,并用体外实验考察了各个时间点不同方法所处理动物的BALF对肺成纤维细胞细胞增殖和细胞外基质合成的影响。我们检测了各个时间点(d1、d3、d7、d14、d21和d28)的肺组织损伤(MDA、LDH、蛋白渗透、细胞凋亡)、炎症反应(MPO、TGF-β1、TNF-α、MCP-1、炎症细胞分类计数、肺泡炎半定量评分)、间质纤维化程度(HP、Collagen-I、ET-1、PDGF-BB、α-SMA、纤维化半定量评分)和缺氧程度( HYTM-1、HIF-1α)等相关指标,考察DS1抑制BLM诱导的大鼠肺纤维化的时效性和可能的机制;体外实验用人胚胎肺成纤维细胞(WI-38)和原代培养的大鼠肺成纤维细胞评价DS1治疗组BALF对细胞增殖和胶原合成的抑制作用。结果显示,给予DS1可降低BLM诱发的各个时间点大鼠肺组织中炎症因子TNF-α和MCP-1的高表达,组织中MDA的产生和MPO的活性,肺组织细胞的凋亡,和BALF中LDH的活性、蛋白和炎症细胞的含量;DS1也能抑制诱导成纤维细胞增殖的细胞因子TGF-β,PDGF-BB和ET-1的高表达,治疗组的肺泡灌洗液促进肺成纤维细胞细胞增殖和胶原合成的能力也远远弱于模型组;此外,DS1能明显减轻BLM诱导的肺组织的缺氧程度和HIF-1α的蛋白表达。
本研究的第三部分:建立体外肺成纤维细胞缺氧模型,考察缺氧参与纤维化的机制和DS1对抗缺氧的可能信号通路。利用体外培养原代肺成纤维细胞,检测了缺氧对肺成纤维细胞增殖和纤维化因子CTGF的影响,使用HIF-1αsiRNA明确了HIF-1α在肺成纤维细胞增殖中的重要作用以及对纤维化效应因子CTGF调控作用;并用PKC抑制剂GF109302X、PI3K抑制剂LY294002、MAPK抑制剂U0126和PD98059以及蛋白酶体抑制剂MG-132(Z-Leu-Leu-Leu-CHO)进行干预,进一步探讨HIF-1α参与缺氧引起的肺成纤维细胞细胞增殖与活化的机制以及DS1对这一过程的调控。研究发现:(1)缺氧能迅速诱导肺成纤维细胞HIF-1α高表达,同时也诱导CTGF的表达;(2)DS1和HIF-1α siRNA能显著抑制肺成纤维细胞HIF-1α和CTGF的表达;(3)DS1和PKC抑制剂显著抑制肺成纤维细胞HIF-1α的表达;(4)DS1通过抑制PKC的磷酸化,续而抑制PI3K/AKT和MAPK/ERK通路,降低HIF-1α的转录活性并促进缺氧情况下HIF-1α的降解。
本研究表明:DS1通过减轻肺组织损伤(氧化损伤、凋亡)、炎症、缺氧、成纤维细胞增殖和细胞外基质沉积而减缓肺纤维化的进程。本研究着重探讨缺氧途径对肺纤维化的作用及DS1对该途径的调控机制,结果表明DS1可以通过抑制PKC而降低HIF-1α的转录活性并促进缺氧情况下HIF-1α的降解,从而抑制CTGF的表达,减缓肺纤维化进程。