哺乳动物雷帕霉素靶蛋白mTOR (mammalian target of rapamycin)是一种非典型丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,属于磷酸肌醇激酶相关蛋白激酶家族(phosphoinositide kinase—related kinase, PIKK),它对细胞生长、分化、增殖、迁移和存活都有重要调控作用。mTOR以两种复合物形式存在,分别为mTORC1(mTOR-raptor复合物)和nTORC2(mTOR-rictor复合物)。mTORC1由mTOR、Raptor(regulatory-associated protein of mTOR)、mLS8/GβL (G proteinunit-like protein、PRAS40和Deptor组成,受激素、生长因子、营养、能量、应激等刺激激活,并对雷帕霉素(rapamycin)敏感。mTORC1的激活导致下游信号40S核糖体蛋白激酶(40S ribosomal protein S6kinase1, S6K1)和真核细胞翻译起始因子4E结合蛋白(eukaryotic initiation factor-4E binding protein1,4E-BP1)的磷酸化,从而参与调节细胞生长、增殖、存活、蛋白质翻译、核糖体发生、自噬等重要生物学过程。mTORC2由mTOR、Rictor (rapamycin-insensitive companion of mTOR)、mLS8/GβL、mSinl (SAPK interacting protein1)、 PRR5/Protor和Deptor组成,对雷帕霉素耐受。mTORC2可作用于Akt,但只针对Akt的Ser473位点,并不影响Akt其他位点。其活化Akt(S473)后可调控细胞的生存、代谢、增殖。另外有研究认为,mTORC2在如细胞骨架组织形成等各种生物过程中也有关键作用。有研究发现mTOR信号通路在多种细胞生理活动如血管生成、胰岛素抵抗、脂肪合成以及T淋巴细胞活化等中呈现过度活化状态。也有研究认为,在炎症反应中,mTOR信号通路的激活可以调控炎症。近年来,也有研究发现mTOR信号通路在癌症中高度激活,控制着众多在肿瘤发生发展中至关重要的生物学过程,因此mTOR信号通路是近年来生命科学领域的研究热点。而随着研究的不断深入,mTOR信号通路在多种常见肿瘤如乳腺癌、结直肠癌、前列腺癌、卵巢癌、肝癌、肺癌、白血病及淋巴瘤等发生发展中凸显越来越重要的地位,尽管mTOR抑制剂雷帕霉素(rapamycin)及其类似物已经进入临床试验阶段,但mTOR信号的调控机制仍处于探索阶段,尚未能完全阐明。乳腺癌是当今女性最常见恶性肿瘤之一,世界范围内其发病率呈逐渐上升趋势。在我国,乳腺癌发病率已位居大城市女性恶性肿瘤的第一位。Her-2是由位于染色体17q21的c-erbB2基因编码的具有跨膜酪氨酸激酶(protein tyrosine kinase, PTK)活性的跨膜糖蛋白,简称P185。临床试验证实,Her-2在15%-25%的乳腺癌中有基因扩增和蛋白过表达,使肿瘤细胞更易复发或转移,无病生存期短,预后较差。曲妥珠单抗(Trastuzumab)是以Her-2为靶点的重组人源化单克隆抗体,与c-erbB2受体细胞外区域结合,具有高度亲和力和特异性阻断c-erbB2受体而产生抗肿瘤效应。现已广泛用于治疗Her-2过表达的乳腺癌患者。目前国内在曲妥珠单抗与：nTORC1、mTORC2信号通路的关联性上并无明确研究。本课题通过利用Her-2过表达的乳腺癌细胞株MDA-MB-453,旨在探讨研究曲妥珠单抗对mTORC1、mTORC2信号通路的影响,并观察在mTOR信号通路的影响程度上曲妥珠单抗是否优于雷帕霉素。目的探讨曲妥珠单抗对Her-2过表达乳腺癌细胞株]mTOR信号通路的影响,并观察在mTOR信号通路的影响程度上曲妥珠单抗是否优于雷帕霉素。方法Her-2过表达的乳腺癌细胞株MDA-MB-453为本实验室保存,使用1640培养基,添加10%胎牛血清,在37℃、5%C02培养箱内培养,根据细胞生长速度适时更换培养基,用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA工作液消化分散细胞,进行传代或接种培养。蛋白印迹(Western Blot)检测曲妥珠单抗对mTORC1和mTORC2信号通路的影响。将MDA-MB-453细胞接种于12孔板中,待细胞处于对数生长期后,在6组实验组中加入浓度分别为0.25、0.5、1.0、1.5、2.5和5.0mg/ml的曲妥珠单抗,设1组空白对照组及1组雷帕霉素对照组(雷帕霉素的浓度为0.1mg/ml),空白对照组加入等量生理盐水,孵育2h后提取蛋白,上样,电泳分离,转膜,室温封闭1h,加一抗4℃孵育过夜,加二抗室温孵育1h, ECL显色,曝光,洗片。细胞增殖-毒性检测试剂盒(Cell Counting Kit-8, CCK-8)检测曲妥珠单抗对MDA-MB-453细胞增殖的影响。将生长状态良好的MDA-MB-453细胞调整细胞浓度为2×104个/ml,接种于96孔板,每孔200μl,每组设5个平行孔。培养24h待细胞贴壁后,更换新鲜培养基,分别为含生理盐水的培养基(空白对照组1组)、含有0.1mg/ml雷帕霉素的培养基(雷帕霉素对照组1组)和含有浓度分别为0.5、1.0、1.5、2.5和5.0mg/ml的曲妥珠单抗的培养基(实验组5组),继续培养3天后,按CCK8试剂盒说明书操作,最后用酶标仪测吸光度值(λ=450nm)。平板克隆率试验检测在曲妥珠单抗的作用下乳腺癌细胞的克隆形成能力。将细胞接种于6孔板,每孔密度500个细胞,24h之后更换新鲜培养基,1组空白对照组、5组实验组培养基中分别加入生理盐水和浓度分别为0.5、1.0、1.5、2.5、5.0mg/ml的曲妥珠单抗。继续进行培养,每48h更换1次新鲜培养基,维持培养2周,2周后终止培养,弃去培养液,用PBS液冲洗2次,用甲醇室温固定15min,弃去甲醇,用0.15%结晶紫染液室温染色15min,用流水冲洗2次,室温晾干,拍照统计克隆形成数。显微镜下观察乳腺癌细胞死亡情况。将生长状态良好的MDA-MB-453细胞调整细胞浓度为2×104个/ml,接种于24孔板,24h后待细胞融合密度达30%左右时,更换新鲜培养基,分别为含生理盐水的培养基(空白对照组1组)、含有0.1mg/ml雷帕霉素的培养基(雷帕霉素对照组1组)、含有浓度分别为0.5、1.0、1.5、2.5、5.0mg/ml的曲妥珠单抗的培养基(实验组4组)和含有0.1mg/ml雷帕霉素及浓度分别为0.5、1.0、1.5、2.5、5.0mg/ml的曲妥珠单抗的培养基(联合用药对照组4组),继续培养。每天同一时段对每一孔进行随机拍照,平均每孔三张照片,连续观察6天。实验数据均用SPSS13.0统计软件处理。细胞增殖试验、克隆形成试验所有数据均用x±s表示。如果方差齐,采用方差分析(One-Way ANOVA)多组间比较,然后采用LSD法进行两两比较,如果方差不齐,采用Welch法多组间比较,然后采用Dunnet’s T3方法进行两两比较。检验水准a=0.05。结果Western Blot结果显示：雷帕霉素对照组的mTOR、S6、4EBP1磷酸化明显受抑制,实验组随曲妥珠单抗浓度的增大,mTOR、S6、4EBP1、Akt磷酸化水平越低,并且随着曲妥珠单抗的浓度增大,其对乳腺癌细胞mTOR信号通路的抑制效果较之雷帕霉素组更加明显。CCK8试剂盒检测结果显示：空白对照组OD值为1.79±0.07,雷帕霉素对照组OD值为1.47±0.08,曲妥珠单抗实验组的OD值依浓度变化分别为1.37±0.11、1.28±0.03、1.03±0.09、0.68±0.09、0.37±0.03,对上述5个实验组和1个空白对照组进行方差齐性检验,6组数据的方差齐(P=0.083)；方差分析的结果显示,6组数据至少有2组的差异有统计学意义(F=221.863,P=0.000)。利用LSD法进行两两比较,与空白对照组相比,所有曲妥珠单抗实验组均可抑制MDA-MB-453细胞增殖,差异具有统计学意义(均为P=0.000)。根据细胞相对增殖率公式可得曲妥珠单抗实验组的细胞相对增殖率依浓度变化分别为(77±6.3)%、(71±1.5)%、(57±4.9)%、(38±5.1)%、(21±1.5)%,而雷帕霉素对照组的相对增殖率为(82±4.6)%。与空白对照组相比,雷帕霉素对照组可抑制MDA-MB-453细胞增殖,差异具有统计学意义(P=0.000)。6组克隆形成数据显示：对照组与实验组的均值分别为每孔(519±32)、(283±23)、(140±18)、(110±12)、(83±10)和(19±6)个,克隆形成率分别为(100±6)%、(55±4)%、(27±3)%、(21±2)%、(16±2)%、(4±1)%。对上述6组克隆数据进行方差齐性检验,6组数据的方差齐(P=0.052)；方差分析的结果显示,6组数据至少有2组的差异有统计学意义(F=372.643,P=0.000)。利用LSD法进行两两比较,与空白对照组相比,所有曲妥珠单抗实验组P=0.000。在显微镜下连续6天观察细胞死亡情况时发现,乳腺癌MDA-MB-453细胞为半悬浮圆形细胞,呈葡萄串样生长。使用药物6天后,不论是单药曲妥珠单抗组还是联合用药组,细胞数目都随曲妥珠单抗浓度增大而减少。但单用雷帕霉素从图片上看并不比曲妥珠单抗效果好,联合用药图片所见与曲妥珠单抗单药效果相差也不大,并且2.5mg/ml曲妥珠单抗+0.1mg/ml雷帕霉素药物组细胞数目却比2.5mg/ml曲妥珠单抗药物组多。结论曲妥珠单抗作为针对Her-2靶点的有效药物,可通过mTORC1、mTORC2信号通路对乳腺癌细胞株MDA-MB-453起到浓度依赖性抑制作用,从而抑制肿瘤细胞的生长、增殖。并且曲妥珠单抗对Her-2过表达乳腺癌细胞的mTORC1、 mTORC2信号通路抑制效果优于雷帕霉素。