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脊髓小脑共济失调3型（SCA3）主要病理改变是小脑和脑干神经元内大量异常蛋白聚集物的沉积，该过程又称包涵体的形成。近期的研究提示SCA3转基因小鼠的脑蛋白裂解液中存在CHIP蛋白的明显下调，但导致CHIP蛋白下调的具体分子机制及CHIP蛋白降低对SCA3发病的影响仍未得到全面的研究及阐述。有研究推测SCA3小鼠可能也存在应激不耐受，那么SCA3相关模型中是否存在应激不耐受以及引起应激不耐受的机制是否与CHIP蛋白的水平降低有关需要进一步探究。
由于SCA3的临床表现具有异质性，与HD，脊髓侧索硬化症，帕金森综合征，脊髓延髓萎缩症以及其它类型的脊髓小脑共济失调的鉴别诊断比较困难，外显子测序成为唯一诊断该疾病的准确方法，但是外显子测序费用较高，所需时间较长，不适合对门诊病人的初筛。生物标志物是一种近年来发展的用来标记系统、器官、组织、细胞及亚细胞功能或结构改变的指标，可用于疾病的诊断、药物评价等。目前针对SCA3的研究主要集中在中枢神经系统的病理改变，对生物标志物的研究尚少。因此，寻找能够作为临床疾病检测的生物标志物对SCA3的诊断，监测SCA3进展以及评价治疗效果具有重要的意义。
目的：
1.运用SCA3转基因小鼠、SCA3稳定细胞系、SCA3病人来源的皮肤成纤维细胞及诱导多功能干细胞（iPSC）分化而来的神经干细胞（NSC），从转录、翻译、蛋白分布及降解途径探索CHIP蛋白在SCA3相关模型中降低的分子机制。
2.采用热应激及在SCA3细胞模型中过表达CHIP蛋白的方法，探讨CHIP蛋白是否参与SCA3的应激不耐受及相关的分子机制。
3.检测正常人及SCA3患者的血清CHIP蛋白水平，比较正常人及SCA3患者血清中CHIP蛋白水平，探讨CHIP蛋白是否可作为SCA3的生物标志物。
方法：
1.采用慢病毒感染N2a细胞的方法构建表达空载体的LV-细胞、表达野生型Ataxin3的LV-Q28细胞及表达突变型Ataxin3的LV-Q84细胞。取正常人及SCA3患者的皮肤，原代培养皮肤成纤维细胞。
2.检测上述细胞在培养的24h,48h和72h的细胞活力及凋亡水平。
3.提取上述构建的稳定细胞系、皮肤成纤维细胞及不同周龄(weeks)SCA3转基因小鼠的蛋白，检测CHIP蛋白水平并分析SCA3小鼠周龄的增加与CHIP蛋白水平变化的关系。
4.分别提取上述细胞及40w的转基因小鼠的大脑及小脑总RNA，检测CHIP及Ataxin3在转录水平的改变。
5.采用稳定细胞系，皮肤成纤维细胞及40w的转基因小鼠，检测CHIP蛋白在可溶及不可溶性蛋白中的水平，细胞免疫荧光检测Ataxin3/PolyQ和CHIP蛋白是否存在共定位及有无包涵体形成；同时检测Ataxin3/PolyQ与CHIP蛋白在24w及40w的SCA3小鼠脑干及小脑的分布及有无包涵体形成，比较24w及40w小鼠包涵体的大小及数目的差异。
6.用10μM的蛋白酶体抑制剂（MG132）抑制LV-、LV-Q28及LV-Q84细胞的蛋白酶体通路，泛素化分析各组细胞的CHIP蛋白泛素化水平；用MG132和PI3K自噬抑制剂（3-MA）分别抑制LV-、LV-Q28及LV-Q84细胞的蛋白酶体通路和自噬溶酶体通路，Western blot检测给药前后各组细胞的CHIP蛋白增量的差异，分析蛋白降解改变对SCA3中CHIP蛋白的影响。
7.运用正常人及SCA3患者来源的皮肤成纤维细胞重编程iPSC，并进一步诱导分化为NSC，检测SCA3患者来源的NSC及正常人的NSC细胞中CHIP蛋白有无差异。
8.将LV-、LV-Q28及LV-Q84细胞及上述提取的皮肤成纤维细胞置于42℃细胞培养箱内4h，采用非变性凝胶电泳、Western blot及免疫荧光技术检测应激相关蛋白水平，免疫共沉淀检测Ataxin3与应激相关蛋白的相互作用，分析SCA3细胞的应激不耐受。
9.用表达CHIP的慢病毒感染LV-Q84细胞及上述提取的SCA3皮肤成纤维细胞。将上述细胞置于42℃细胞培养箱内4h后继续培养，在24h,48h及72h后用CCK8法检测细胞的活力，免疫荧光观察细胞中包涵体的数量，Western blot检测相关蛋白的表达，进而分析CHIP蛋白的保护作用。
10.由于SCA3为比较罕见的遗传病，本研究进行了探索性病例对照研究，共收集了80名SCA3患者和年龄性别相匹配的正常人的血清，酶联免疫吸附实验（ELISA）检测CHIP蛋白水平，Student’s t检验分析正常人及SCA3患者的血清CHIP蛋白水平是否存在差异，用Pearson相关性分析检测血清CHIP蛋白水平与患者的发病年龄、性别、病程持续时间及SARA和ICARS评分之间的相关性，采用多重回归模型分析血清中CHIP蛋白浓度的影响因素。
结果：
1.成功构建了过表达空白载体的LV-细胞、野生型Ataxin3的LV-Q28细胞及突变型Ataxin3的LV-Q84细胞，并成功分离培养了两名SCA3患者和一名年龄性别相匹配的正常人的皮肤成纤维细胞。
2.在培养的24h,48h及72h，LV-Q84细胞的活力明显低于LV-Q28细胞.P＜0.05，差异有统计学意义。相似的结果出现在SCA3患者来源的皮肤成纤维细胞中。
3.LV-Q84细胞的CHIP蛋白水平明显低于LV-Q28细胞，P＜0.05，差异有统计学意义。相似的结果出现于SCA3患者来源的皮肤成纤维中。此外，40w的SCA3纯合小鼠的CHIP蛋白水平较杂合突变型及野生型小鼠依次明显降低，P＜0.05。SCA3小鼠小脑中CHIP蛋白含量随疾病的进展逐渐降低：排序依次为1w的野生小鼠，1w纯合突变型SCA3小鼠，18w纯合突变SCA3小鼠，40w纯合突变SCA3小鼠，P＜0.05，差异有统计学意义。
4.在上述SCA3细胞模型及40w的SCA3转基因小鼠中未观察到CHIP的mRNA水平改变，40w的纯合SCA3小鼠的大小脑内Ataxin3的mRNA水平明显高于杂合SCA3小鼠，杂合SCA3小鼠的Ataxin3的mRNA明显高于野生型，P＜0.05，差异有统计学意义。
5.LV-Q84细胞的可溶性蛋白中的CHIP蛋白水平明显低于LV-Q28细胞，但LV-Q84的不可溶性蛋白中的CHIP蛋白水平明显高于LV-Q28细胞，P＜0.05，差异有统计学意义。相似的结果出现在皮肤成纤维细胞中。比较可溶性蛋白中CHIP蛋白水平显示：40w的纯合SCA3小鼠明显低于相同周龄的杂合SCA3小鼠，更低于野生型小鼠，而在不可溶性蛋白中得到了相反的结果。P＜0.05，差异有统计学意义。在LV-Q84细胞，SCA3患者来源的皮肤成纤维细胞及SCA3杂合和纯合转基因小鼠中均发现了Ataxin3与CHIP蛋白共定位于包涵体内。24w和40w的SCA3小鼠的小脑及脑干中检测到包涵体，且24w小鼠的包涵体数量明显小于相同基因型的40w的SCA3小鼠，P＜0.05，差异有统计学意义。
6.泛素化分析显示，LV-Q84细胞CHIP蛋白的泛素化水平低于LV-Q28细胞；分别抑制各组细胞的蛋白酶体通路及自噬溶酶体通路后，各细胞组CHIP蛋白的增量差别不明显。
7.SCA3患者来源的NSC细胞中的CHIP蛋白水平较正常人明显增高，且细胞内未检测到包涵体。
8.热应激后，非变性凝胶电泳显示：LV-Q84细胞的三聚体HSF1水平明显低于LV-Q28细胞。热应激后应激相关蛋白DNAJB1在LV-Q84细胞中升高的水平明显低于LV-Q28细胞，且LV-Q84细胞中DNAJB1的mRNA升高水平低于LV-Q28细胞P＜0.05，差异有统计学意义，相似的结果出现在皮肤成纤维细胞中。免疫共沉淀显示突变的Ataxin3蛋白与DNAJB1存在相互作用，而野生型Ataxin3蛋白与DNAJB1的相互作用未检测到。
9.过表达CHIP的LV-Q84细胞的包涵体数量明显低于LV-Q84细胞；热应激后，过表达CHIP的LV-Q84细胞的细胞活力较LV-Q84细胞高，且应激相关蛋白DNAJB1升高水平明显增加，P＜0.05。
10.SCA3患者和正常人的血清CHIP蛋白水平分别为(80.93±28.68)ng/mL和(40.37±18.55)ng/mL，统计学分析显示P＜0.05。相关分析显示：年龄、发病年龄、疾病持续时间被剔出，SARA和ICARS评分与血清CHIP蛋白水平独立相关（SARA：β=0.500,P=0.034;ICARS：β=0.561,P=0.015）。
结论：
1.大量CHIP蛋白被隔离于包涵体中引起CHIP蛋白的分布异常，导致了CHIP蛋白在SCA3疾病模型中的降低。
2.SCA3细胞模型中活化状态的三聚体HSF1水平降低，致使DNAJB1的转录激活不足，导致细胞产生应激不耐受。过表达CHIP蛋白能够显著改善SCA3细胞模型的应激不耐受，发挥保护作用。
3.和正常对照相比SCA3患者的血清CHIP蛋白水平存在明显升高，并和疾病严重程度相关，有希望作为SCA3的生物标志物。
由于SCA3的临床表现具有异质性，与HD，脊髓侧索硬化症，帕金森综合征，脊髓延髓萎缩症以及其它类型的脊髓小脑共济失调的鉴别诊断比较困难，外显子测序成为唯一诊断该疾病的准确方法，但是外显子测序费用较高，所需时间较长，不适合对门诊病人的初筛。生物标志物是一种近年来发展的用来标记系统、器官、组织、细胞及亚细胞功能或结构改变的指标，可用于疾病的诊断、药物评价等。目前针对SCA3的研究主要集中在中枢神经系统的病理改变，对生物标志物的研究尚少。因此，寻找能够作为临床疾病检测的生物标志物对SCA3的诊断，监测SCA3进展以及评价治疗效果具有重要的意义。
目的：
1.运用SCA3转基因小鼠、SCA3稳定细胞系、SCA3病人来源的皮肤成纤维细胞及诱导多功能干细胞（iPSC）分化而来的神经干细胞（NSC），从转录、翻译、蛋白分布及降解途径探索CHIP蛋白在SCA3相关模型中降低的分子机制。
2.采用热应激及在SCA3细胞模型中过表达CHIP蛋白的方法，探讨CHIP蛋白是否参与SCA3的应激不耐受及相关的分子机制。
3.检测正常人及SCA3患者的血清CHIP蛋白水平，比较正常人及SCA3患者血清中CHIP蛋白水平，探讨CHIP蛋白是否可作为SCA3的生物标志物。
方法：
1.采用慢病毒感染N2a细胞的方法构建表达空载体的LV-细胞、表达野生型Ataxin3的LV-Q28细胞及表达突变型Ataxin3的LV-Q84细胞。取正常人及SCA3患者的皮肤，原代培养皮肤成纤维细胞。
2.检测上述细胞在培养的24h,48h和72h的细胞活力及凋亡水平。
3.提取上述构建的稳定细胞系、皮肤成纤维细胞及不同周龄(weeks)SCA3转基因小鼠的蛋白，检测CHIP蛋白水平并分析SCA3小鼠周龄的增加与CHIP蛋白水平变化的关系。
4.分别提取上述细胞及40w的转基因小鼠的大脑及小脑总RNA，检测CHIP及Ataxin3在转录水平的改变。
5.采用稳定细胞系，皮肤成纤维细胞及40w的转基因小鼠，检测CHIP蛋白在可溶及不可溶性蛋白中的水平，细胞免疫荧光检测Ataxin3/PolyQ和CHIP蛋白是否存在共定位及有无包涵体形成；同时检测Ataxin3/PolyQ与CHIP蛋白在24w及40w的SCA3小鼠脑干及小脑的分布及有无包涵体形成，比较24w及40w小鼠包涵体的大小及数目的差异。
6.用10μM的蛋白酶体抑制剂（MG132）抑制LV-、LV-Q28及LV-Q84细胞的蛋白酶体通路，泛素化分析各组细胞的CHIP蛋白泛素化水平；用MG132和PI3K自噬抑制剂（3-MA）分别抑制LV-、LV-Q28及LV-Q84细胞的蛋白酶体通路和自噬溶酶体通路，Western blot检测给药前后各组细胞的CHIP蛋白增量的差异，分析蛋白降解改变对SCA3中CHIP蛋白的影响。
7.运用正常人及SCA3患者来源的皮肤成纤维细胞重编程iPSC，并进一步诱导分化为NSC，检测SCA3患者来源的NSC及正常人的NSC细胞中CHIP蛋白有无差异。
8.将LV-、LV-Q28及LV-Q84细胞及上述提取的皮肤成纤维细胞置于42℃细胞培养箱内4h，采用非变性凝胶电泳、Western blot及免疫荧光技术检测应激相关蛋白水平，免疫共沉淀检测Ataxin3与应激相关蛋白的相互作用，分析SCA3细胞的应激不耐受。
9.用表达CHIP的慢病毒感染LV-Q84细胞及上述提取的SCA3皮肤成纤维细胞。将上述细胞置于42℃细胞培养箱内4h后继续培养，在24h,48h及72h后用CCK8法检测细胞的活力，免疫荧光观察细胞中包涵体的数量，Western blot检测相关蛋白的表达，进而分析CHIP蛋白的保护作用。
10.由于SCA3为比较罕见的遗传病，本研究进行了探索性病例对照研究，共收集了80名SCA3患者和年龄性别相匹配的正常人的血清，酶联免疫吸附实验（ELISA）检测CHIP蛋白水平，Student’s t检验分析正常人及SCA3患者的血清CHIP蛋白水平是否存在差异，用Pearson相关性分析检测血清CHIP蛋白水平与患者的发病年龄、性别、病程持续时间及SARA和ICARS评分之间的相关性，采用多重回归模型分析血清中CHIP蛋白浓度的影响因素。
结果：
1.成功构建了过表达空白载体的LV-细胞、野生型Ataxin3的LV-Q28细胞及突变型Ataxin3的LV-Q84细胞，并成功分离培养了两名SCA3患者和一名年龄性别相匹配的正常人的皮肤成纤维细胞。
2.在培养的24h,48h及72h，LV-Q84细胞的活力明显低于LV-Q28细胞.P＜0.05，差异有统计学意义。相似的结果出现在SCA3患者来源的皮肤成纤维细胞中。
3.LV-Q84细胞的CHIP蛋白水平明显低于LV-Q28细胞，P＜0.05，差异有统计学意义。相似的结果出现于SCA3患者来源的皮肤成纤维中。此外，40w的SCA3纯合小鼠的CHIP蛋白水平较杂合突变型及野生型小鼠依次明显降低，P＜0.05。SCA3小鼠小脑中CHIP蛋白含量随疾病的进展逐渐降低：排序依次为1w的野生小鼠，1w纯合突变型SCA3小鼠，18w纯合突变SCA3小鼠，40w纯合突变SCA3小鼠，P＜0.05，差异有统计学意义。
4.在上述SCA3细胞模型及40w的SCA3转基因小鼠中未观察到CHIP的mRNA水平改变，40w的纯合SCA3小鼠的大小脑内Ataxin3的mRNA水平明显高于杂合SCA3小鼠，杂合SCA3小鼠的Ataxin3的mRNA明显高于野生型，P＜0.05，差异有统计学意义。
5.LV-Q84细胞的可溶性蛋白中的CHIP蛋白水平明显低于LV-Q28细胞，但LV-Q84的不可溶性蛋白中的CHIP蛋白水平明显高于LV-Q28细胞，P＜0.05，差异有统计学意义。相似的结果出现在皮肤成纤维细胞中。比较可溶性蛋白中CHIP蛋白水平显示：40w的纯合SCA3小鼠明显低于相同周龄的杂合SCA3小鼠，更低于野生型小鼠，而在不可溶性蛋白中得到了相反的结果。P＜0.05，差异有统计学意义。在LV-Q84细胞，SCA3患者来源的皮肤成纤维细胞及SCA3杂合和纯合转基因小鼠中均发现了Ataxin3与CHIP蛋白共定位于包涵体内。24w和40w的SCA3小鼠的小脑及脑干中检测到包涵体，且24w小鼠的包涵体数量明显小于相同基因型的40w的SCA3小鼠，P＜0.05，差异有统计学意义。
6.泛素化分析显示，LV-Q84细胞CHIP蛋白的泛素化水平低于LV-Q28细胞；分别抑制各组细胞的蛋白酶体通路及自噬溶酶体通路后，各细胞组CHIP蛋白的增量差别不明显。
7.SCA3患者来源的NSC细胞中的CHIP蛋白水平较正常人明显增高，且细胞内未检测到包涵体。
8.热应激后，非变性凝胶电泳显示：LV-Q84细胞的三聚体HSF1水平明显低于LV-Q28细胞。热应激后应激相关蛋白DNAJB1在LV-Q84细胞中升高的水平明显低于LV-Q28细胞，且LV-Q84细胞中DNAJB1的mRNA升高水平低于LV-Q28细胞P＜0.05，差异有统计学意义，相似的结果出现在皮肤成纤维细胞中。免疫共沉淀显示突变的Ataxin3蛋白与DNAJB1存在相互作用，而野生型Ataxin3蛋白与DNAJB1的相互作用未检测到。
9.过表达CHIP的LV-Q84细胞的包涵体数量明显低于LV-Q84细胞；热应激后，过表达CHIP的LV-Q84细胞的细胞活力较LV-Q84细胞高，且应激相关蛋白DNAJB1升高水平明显增加，P＜0.05。
10.SCA3患者和正常人的血清CHIP蛋白水平分别为(80.93±28.68)ng/mL和(40.37±18.55)ng/mL，统计学分析显示P＜0.05。相关分析显示：年龄、发病年龄、疾病持续时间被剔出，SARA和ICARS评分与血清CHIP蛋白水平独立相关（SARA：β=0.500,P=0.034;ICARS：β=0.561,P=0.015）。
结论：
1.大量CHIP蛋白被隔离于包涵体中引起CHIP蛋白的分布异常，导致了CHIP蛋白在SCA3疾病模型中的降低。
2.SCA3细胞模型中活化状态的三聚体HSF1水平降低，致使DNAJB1的转录激活不足，导致细胞产生应激不耐受。过表达CHIP蛋白能够显著改善SCA3细胞模型的应激不耐受，发挥保护作用。
3.和正常对照相比SCA3患者的血清CHIP蛋白水平存在明显升高，并和疾病严重程度相关，有希望作为SCA3的生物标志物。