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本研究主要分为三部分。
第一部分 甲型流感病毒与单纯疱疹病毒1型双重感染小鼠模型的建立
目的:
建立甲型流感病毒与单纯疱疹病毒1型双重感染小鼠模型。
方法:
1.采用 SPF级鸡胚扩增甲型流感病毒 A/Puerto Rico/8(H1N1)和A/Aichi/2/1968(H3N2)毒株；采用Vero细胞扩增HSV-1病毒。空斑法测定三种病毒的病毒滴度。
2.分别采用不同剂量的H1N1、H3N2、HSV-1毒株感染C57BL/6小鼠，建立病毒感染小鼠的生存曲线。
3.于H1N1或H3N2感染前、感染后3天给予PBS（Mock）滴鼻，每天监测小鼠体重、生存率、肺指数、病毒滴度及肺病理变化，评估PBS滴鼻对IAV病毒感染的影响及明确后续建立双重感染模型H1N1、H3N2的感染剂量。
4.选择合适剂量H3N2与HSV-1，建立H3N2与HSV-1双重感染小鼠模型
5．分别于H3N2感染后第4天、6天、8天和10天检测小鼠肺指数、肺泡灌洗液（BALF）及肺组织均浆中H3N2与HSV-1病毒滴度。
6．于H3N2感染后第8天采用HE染色检测肺病理改变。
结果:
1.空斑法测定H1N1病毒滴度为1×108 PFU/mL，H3N2病毒滴度为6×107 PFU/mL，HSV-1的病毒滴度为108PFU/mL。
2. H1N1、H3N2及HSV-1感染C57BL/6小鼠的生存曲线结果显示，H1N1和H3N2病毒感染可以引起小鼠体重下降，出现死亡；其中H1N1感染小鼠的亚致死剂量为15 PFU/50μL和10 PFU/50μL，H3N2感染小鼠的亚致死剂量为200 PFU/50μL、HSV-1感染小鼠的亚致死剂量为104PFU/50μL。
3. H1N1或H3N2感染后3天，PBS滴鼻模拟二次感染可引起小鼠体重显著下降，死亡率增加、病毒载量升高及严重的肺损伤（P<0.05）；但感染顺序相反或PBS与H1N1或H3N2同时感染，则不会出现上述现象。
4. PBS滴鼻后，为达到相似致病性，PBS-H3N2组与H3N2+PBS组的H3N2感染剂量相同；而H3N2-PBS组的H3N2感染剂量比H3N2+PBS共感染组低20倍才能达到相似致病性。
5. HSV-1-H3N2重叠感染模型中，HSV-1-H3N2组与Mock-H3N2组相比，小鼠体重下降程度、肺指数、病毒载量、肺损伤程度均降低（P<0.05）。
6. H3N2+HSV-1共感染模型中，H3N2+HSV-1组小鼠体重下降、死亡率、肺指数、H3N2病毒载量及肺损伤程度均高于H3N2单独感染组（P<0.05）。
7. H3N2-HSV-1重叠感染模型中，H3N2-HSV-1组小鼠体重下降程度、死亡率、肺指数、H3N2病毒载量及肺损伤程度明显高于H3N2-Mock组（P<0.05）。
8.三种模型中的双重感染组进行横向比较发现，H3N2病毒载量及肺损伤程度由高到低依次为H3N2-HSV-1组、H3N2+HSV-1组、HSV-1-H3N2组。
结论:
1. IAV后使用PBS滴鼻可引起IAV病毒滴度升高，促进小鼠肺损伤及死亡。
2.成功建立H3N2与HSV-1双重感染小鼠模型。
3. H3N2与HSV-1双重感染的致病性差异与两种病毒感染的先后顺序密切相关。HSV-1预先感染可以降低H3N2感染引起的肺损伤及死亡率，而H3N2继发或同时合并HSV-1感染则致病性显著增加，其中H3N2-HSV-1组致病性最高。
第二部分 甲型流感病毒与单纯疱疹病毒1型双重感染的免疫细胞学研究
目的:
探讨小鼠H3N2与HSV-1双重感染致的免疫细胞学变化。
方法:
1.采用第一部分的方法，建立 H3N2与 HSV-1双重感染小鼠模型：HSV-1+H3N2共感染模型、HSV-1-H3N2重叠感染模型和H3N2-HSV-1重叠感染模型。三种模型中分别设立单独病毒感染组和空白对照组，空白组采用PBS模拟感染，三种模型均以H3N2感染时间点为第0天。
2. Luminex技术分析三种模型在H3N2感染后第6天、第8天BALF中细胞因子变化。
3.分析固有免疫细胞变化：于H3N2感染后第6天、8天检测小鼠BALF、肺、脾NK细胞、pDC细胞、IKDC细胞、M?细胞的表达量。
4.分析适应性免疫细胞变化：于H3N2感染后第6天、8天检测小鼠BALF、肺、脾中B细胞及CD4、CD8 T细胞的变化。于H3N2感染后第10天检测分泌的IFN-γ、TNF-α、IL-2的病毒特异性CD8 T细胞表达量。
结果:
1. HSV-1-H3N2重叠感染模型中，HSV-1-H3N2组固有免疫细胞及效应性T细胞反应提前，感染后期NK、pDC、IKDC、M?、TEM的表达量比Mock-H3N2组低（P<0.05）；HSV-1-H3N2组与Mock-H3N2组相比，分泌IFN-γ、TNF-α、IL-2的H3N2病毒特异性CD8 T细胞表达量低。（P<0.05）。
2. H3N2+HSV-1共感染模型：固有免疫细胞反应结果显示，H3N2+HSV-1组产生的固有免疫细胞NK、pDC、IKDC、M?表达量比H3N2单独感染组低（P<0.05），不能及时提供感染早期的抗病毒反应，导致早期肺组织H3N2病毒载量高于H3N2组（P<0.05）。适应性免疫细胞结果显示：H3N2+HSV-1组刺激机体产生较高的T细胞反应，CD4、CD8 T细胞及TEM细胞明显高于H3N2组，并于感染后第10天达到高峰，分泌IFN-γ、TNF-α、IL-2的病毒特异性CD8 T细胞也显著升高。（P<0.05）
3. H3N2-HSV-1重叠感染模型中，H3N2-HSV-1组产生的NK、pDC、IKDC、M?等固有免疫细胞高于H3N2-Mock组，而T细胞反应较弱，TEM表达量较低，同时伴随大量细胞因子产生，出现免疫功能紊乱，导致病毒清除减慢、肺损伤加重。H3N2-HSV-1组的H3N2高病毒载量引起感染后期机体产生强烈的病毒特异性CD8 T细胞反应，分泌IFN-γ、TNF-α、IL-2的CD8 T细胞高于对照组（P<0.05）。
结论:
1. HSV-1预先感染可以降低再次感染H3N2引起的肺损伤和死亡率，这与HSV-1提前感染通过激活固有免疫反应及增强T细胞反应，促进机体产生抗病毒效应，促进病毒清除，降低炎症反应等有关。
2. H3N2与HSV-1共同感染致病性增加，这与共感染后固有免疫反应较弱，机体不能有效抗病毒反应有关，持续的病毒复制，损害呼吸道粘膜上皮细胞，加重肺部炎症。
3. H3N2继发HSV-1感染肺损伤重、死亡率高，这与其重叠感染后T细胞反应弱及免疫失衡有关，机体不能有效抑制病毒复制，导致细胞因子大量产生和持续性炎症反应。
4.固有免疫细胞与适应性细胞在调节H3N2与HSV-1双重感染的致病性、控制病毒复制等过程中发挥重要作用。
第三部分 单纯疱疹病毒1型与鼻病毒共感染的临床病例观察研究
目的:
探讨免疫学因素在单纯疱疹病毒1型与鼻病毒共感染中的作用。
方法:
1.分析一例的致死性单纯疱疹病毒1型(HSV-1)与鼻病毒(RV)共感染病例， RT-PCR方法检测患者咽拭子与痰中HSV-1、RV的病毒载量。
2.采用Luminex液相芯片技术分析不同时间点患者血清及痰上清中41种细胞因子和趋化因子、8种基质金属蛋白酶、4种金属蛋白酶组织抑制剂的表达量。
3.流式细胞术分析不同时间点患者PBMC中NK细胞、B细胞、CD3 T细胞、CD4 T细胞、CD8 T细胞及效应T细胞的变化。
结果:
1. Luminx液相芯片结果发现，患者细胞因子、基质金属蛋白酶及金属蛋白酶组织抑制剂异常升高，达10000 pg/mL以上，促炎因子与抗炎因子失衡，出现细胞因子风暴；热图分析结果显示，炎症因子之间存在强烈的协同关系。
2.流式细胞结果发现CD3、CD4 T细胞和NK细胞的表达较低，B细胞、CD8 T细胞升高，CD4/CD8比值降低提示免疫功能失衡。
3.利巴韦林抗病毒治疗后，病毒载量及炎症因子下降，提示抗病毒作用可能有效。
结论:
细胞因子风暴及免疫失衡是导致HSV-1与RV共感染后病情快速进展及预后差的主要原因。
全文总结
本研究以重症流感患者合并HSV-1感染的临床病例为切入点，成功建立了H3N2与HSV-1双重感染小鼠模型，探讨了双重感染的致病性及相关的免疫细胞学变化，初步阐明了呼吸道HSV-1感染的重要影响。最后通过一例HSV-1与RV共感染临床观察研究，再次证明HSV-1感染对呼吸道病毒共感染的影响及免疫学因素在双重感染致病过程中的作用。本研究初步实现了临床与基础研究之间的相互转化，并首次建立了H3N2与HSV-1双重感染模型，具有一定的创新性。但是呼吸道病毒双重感染是一个复杂、易变的过程，未来需要更深入的机制研究，从而为临床处理呼吸道病毒双重感染问题提供新思路和策略。
第一部分 甲型流感病毒与单纯疱疹病毒1型双重感染小鼠模型的建立
目的:
建立甲型流感病毒与单纯疱疹病毒1型双重感染小鼠模型。
方法:
1.采用 SPF级鸡胚扩增甲型流感病毒 A/Puerto Rico/8(H1N1)和A/Aichi/2/1968(H3N2)毒株；采用Vero细胞扩增HSV-1病毒。空斑法测定三种病毒的病毒滴度。
2.分别采用不同剂量的H1N1、H3N2、HSV-1毒株感染C57BL/6小鼠，建立病毒感染小鼠的生存曲线。
3.于H1N1或H3N2感染前、感染后3天给予PBS（Mock）滴鼻，每天监测小鼠体重、生存率、肺指数、病毒滴度及肺病理变化，评估PBS滴鼻对IAV病毒感染的影响及明确后续建立双重感染模型H1N1、H3N2的感染剂量。
4.选择合适剂量H3N2与HSV-1，建立H3N2与HSV-1双重感染小鼠模型
5．分别于H3N2感染后第4天、6天、8天和10天检测小鼠肺指数、肺泡灌洗液（BALF）及肺组织均浆中H3N2与HSV-1病毒滴度。
6．于H3N2感染后第8天采用HE染色检测肺病理改变。
结果:
1.空斑法测定H1N1病毒滴度为1×108 PFU/mL，H3N2病毒滴度为6×107 PFU/mL，HSV-1的病毒滴度为108PFU/mL。
2. H1N1、H3N2及HSV-1感染C57BL/6小鼠的生存曲线结果显示，H1N1和H3N2病毒感染可以引起小鼠体重下降，出现死亡；其中H1N1感染小鼠的亚致死剂量为15 PFU/50μL和10 PFU/50μL，H3N2感染小鼠的亚致死剂量为200 PFU/50μL、HSV-1感染小鼠的亚致死剂量为104PFU/50μL。
3. H1N1或H3N2感染后3天，PBS滴鼻模拟二次感染可引起小鼠体重显著下降，死亡率增加、病毒载量升高及严重的肺损伤（P<0.05）；但感染顺序相反或PBS与H1N1或H3N2同时感染，则不会出现上述现象。
4. PBS滴鼻后，为达到相似致病性，PBS-H3N2组与H3N2+PBS组的H3N2感染剂量相同；而H3N2-PBS组的H3N2感染剂量比H3N2+PBS共感染组低20倍才能达到相似致病性。
5. HSV-1-H3N2重叠感染模型中，HSV-1-H3N2组与Mock-H3N2组相比，小鼠体重下降程度、肺指数、病毒载量、肺损伤程度均降低（P<0.05）。
6. H3N2+HSV-1共感染模型中，H3N2+HSV-1组小鼠体重下降、死亡率、肺指数、H3N2病毒载量及肺损伤程度均高于H3N2单独感染组（P<0.05）。
7. H3N2-HSV-1重叠感染模型中，H3N2-HSV-1组小鼠体重下降程度、死亡率、肺指数、H3N2病毒载量及肺损伤程度明显高于H3N2-Mock组（P<0.05）。
8.三种模型中的双重感染组进行横向比较发现，H3N2病毒载量及肺损伤程度由高到低依次为H3N2-HSV-1组、H3N2+HSV-1组、HSV-1-H3N2组。
结论:
1. IAV后使用PBS滴鼻可引起IAV病毒滴度升高，促进小鼠肺损伤及死亡。
2.成功建立H3N2与HSV-1双重感染小鼠模型。
3. H3N2与HSV-1双重感染的致病性差异与两种病毒感染的先后顺序密切相关。HSV-1预先感染可以降低H3N2感染引起的肺损伤及死亡率，而H3N2继发或同时合并HSV-1感染则致病性显著增加，其中H3N2-HSV-1组致病性最高。
第二部分 甲型流感病毒与单纯疱疹病毒1型双重感染的免疫细胞学研究
目的:
探讨小鼠H3N2与HSV-1双重感染致的免疫细胞学变化。
方法:
1.采用第一部分的方法，建立 H3N2与 HSV-1双重感染小鼠模型：HSV-1+H3N2共感染模型、HSV-1-H3N2重叠感染模型和H3N2-HSV-1重叠感染模型。三种模型中分别设立单独病毒感染组和空白对照组，空白组采用PBS模拟感染，三种模型均以H3N2感染时间点为第0天。
2. Luminex技术分析三种模型在H3N2感染后第6天、第8天BALF中细胞因子变化。
3.分析固有免疫细胞变化：于H3N2感染后第6天、8天检测小鼠BALF、肺、脾NK细胞、pDC细胞、IKDC细胞、M?细胞的表达量。
4.分析适应性免疫细胞变化：于H3N2感染后第6天、8天检测小鼠BALF、肺、脾中B细胞及CD4、CD8 T细胞的变化。于H3N2感染后第10天检测分泌的IFN-γ、TNF-α、IL-2的病毒特异性CD8 T细胞表达量。
结果:
1. HSV-1-H3N2重叠感染模型中，HSV-1-H3N2组固有免疫细胞及效应性T细胞反应提前，感染后期NK、pDC、IKDC、M?、TEM的表达量比Mock-H3N2组低（P<0.05）；HSV-1-H3N2组与Mock-H3N2组相比，分泌IFN-γ、TNF-α、IL-2的H3N2病毒特异性CD8 T细胞表达量低。（P<0.05）。
2. H3N2+HSV-1共感染模型：固有免疫细胞反应结果显示，H3N2+HSV-1组产生的固有免疫细胞NK、pDC、IKDC、M?表达量比H3N2单独感染组低（P<0.05），不能及时提供感染早期的抗病毒反应，导致早期肺组织H3N2病毒载量高于H3N2组（P<0.05）。适应性免疫细胞结果显示：H3N2+HSV-1组刺激机体产生较高的T细胞反应，CD4、CD8 T细胞及TEM细胞明显高于H3N2组，并于感染后第10天达到高峰，分泌IFN-γ、TNF-α、IL-2的病毒特异性CD8 T细胞也显著升高。（P<0.05）
3. H3N2-HSV-1重叠感染模型中，H3N2-HSV-1组产生的NK、pDC、IKDC、M?等固有免疫细胞高于H3N2-Mock组，而T细胞反应较弱，TEM表达量较低，同时伴随大量细胞因子产生，出现免疫功能紊乱，导致病毒清除减慢、肺损伤加重。H3N2-HSV-1组的H3N2高病毒载量引起感染后期机体产生强烈的病毒特异性CD8 T细胞反应，分泌IFN-γ、TNF-α、IL-2的CD8 T细胞高于对照组（P<0.05）。
结论:
1. HSV-1预先感染可以降低再次感染H3N2引起的肺损伤和死亡率，这与HSV-1提前感染通过激活固有免疫反应及增强T细胞反应，促进机体产生抗病毒效应，促进病毒清除，降低炎症反应等有关。
2. H3N2与HSV-1共同感染致病性增加，这与共感染后固有免疫反应较弱，机体不能有效抗病毒反应有关，持续的病毒复制，损害呼吸道粘膜上皮细胞，加重肺部炎症。
3. H3N2继发HSV-1感染肺损伤重、死亡率高，这与其重叠感染后T细胞反应弱及免疫失衡有关，机体不能有效抑制病毒复制，导致细胞因子大量产生和持续性炎症反应。
4.固有免疫细胞与适应性细胞在调节H3N2与HSV-1双重感染的致病性、控制病毒复制等过程中发挥重要作用。
第三部分 单纯疱疹病毒1型与鼻病毒共感染的临床病例观察研究
目的:
探讨免疫学因素在单纯疱疹病毒1型与鼻病毒共感染中的作用。
方法:
1.分析一例的致死性单纯疱疹病毒1型(HSV-1)与鼻病毒(RV)共感染病例， RT-PCR方法检测患者咽拭子与痰中HSV-1、RV的病毒载量。
2.采用Luminex液相芯片技术分析不同时间点患者血清及痰上清中41种细胞因子和趋化因子、8种基质金属蛋白酶、4种金属蛋白酶组织抑制剂的表达量。
3.流式细胞术分析不同时间点患者PBMC中NK细胞、B细胞、CD3 T细胞、CD4 T细胞、CD8 T细胞及效应T细胞的变化。
结果:
1. Luminx液相芯片结果发现，患者细胞因子、基质金属蛋白酶及金属蛋白酶组织抑制剂异常升高，达10000 pg/mL以上，促炎因子与抗炎因子失衡，出现细胞因子风暴；热图分析结果显示，炎症因子之间存在强烈的协同关系。
2.流式细胞结果发现CD3、CD4 T细胞和NK细胞的表达较低，B细胞、CD8 T细胞升高，CD4/CD8比值降低提示免疫功能失衡。
3.利巴韦林抗病毒治疗后，病毒载量及炎症因子下降，提示抗病毒作用可能有效。
结论:
细胞因子风暴及免疫失衡是导致HSV-1与RV共感染后病情快速进展及预后差的主要原因。
全文总结
本研究以重症流感患者合并HSV-1感染的临床病例为切入点，成功建立了H3N2与HSV-1双重感染小鼠模型，探讨了双重感染的致病性及相关的免疫细胞学变化，初步阐明了呼吸道HSV-1感染的重要影响。最后通过一例HSV-1与RV共感染临床观察研究，再次证明HSV-1感染对呼吸道病毒共感染的影响及免疫学因素在双重感染致病过程中的作用。本研究初步实现了临床与基础研究之间的相互转化，并首次建立了H3N2与HSV-1双重感染模型，具有一定的创新性。但是呼吸道病毒双重感染是一个复杂、易变的过程，未来需要更深入的机制研究，从而为临床处理呼吸道病毒双重感染问题提供新思路和策略。