恶性淋巴瘤是一种血液系统恶性肿瘤,可分为何杰金式淋巴瘤(Hodgkin’s lymphoma, HL)和非何杰金氏淋巴瘤(Non-hodgkin lymphoma, NHL)两大类,放疗与化疗联合应用对HL疗效较佳,但对NHL的疗效较差,故学术界寄希望于免疫治疗。T淋巴细胞可按照其表达的T细胞受体(T cell receptor, TCR)的不同分为两种：αβT淋巴细胞和γδT淋巴细胞。γδT细胞可直接识别应激相关抗原及肿瘤相关抗原,其识别无主要组织相容性复合物(Major histocompability complex, MHC)限制性,对自体、同种异体或异种肿瘤细胞均具有明显的细胞毒作用。因此,γ,δT细胞作为候选免疫过继细胞逐渐成为恶性肿瘤免疫治疗领域的研究热点。山于γδT细胞仅占外周血CD3+T细胞的较少比例(<10%),所以获取足够数量且有相应生物学功能的γδT细胞成为制约其应用十过继免疫治疗的瓶颈问题。本研究利用固相化抗人TCRγδ抗体的扩增技术,可在体外扩增大量人外周血γδT细胞,所获γδT细胞具有较高纯度,目.TCR库容相对完整。为了将γδT细胞真正用于临床过继免疫治疗,我们进行了临床前安全性与有效性评价,为过继自体γδT细胞治疗恶性淋巴瘤奠定了实验基础。首先,我们建立了固相化抗人TCRγδ抗体扩增的γδT细胞制剂的质量和安全监测体系,对γδT细胞制剂的细胞存活率、纯度、稳定性和生物学活性等质量指标,以及无菌、内毒素水平和小鼠IgG残留量等安全性指标进行了检测。研究结果显示yδT细胞制剂的细胞存活率高于90%,纯度达到80%以上,具有较好的细胞稳定性,对多种实体肿瘤细胞和血液肿瘤细胞都表现出良好的细胞毒作用；细胞制剂的无菌、无内毒素检测合格,小鼠IgG残留小于lng/ml。该结果表明,本实验窒制备的γδT细胞制剂符合药典中对生物制品的规定。随后,我们对γδT细胞的培养条件进行了优化。通过检测细胞培养所需要的细胞因子白细胞介素-2(Interleukin-2, IL-2)的代谢规律,确定了培养过程中添加细胞因子的方法；通过利用不同培养基(分别添加或者不添加自体血清)对γδT细胞进行培养,比较了细胞存活率、纯度、扩增效率和生物学功能,确定了最适于临床应用的培养基。最后,我们进行了固相化抗人TCRγδ抗体扩增的γδT细胞用于过继免疫治疗淋巴瘤的有效性研究。国际上常用的体外扩增γδT细胞的方法是以磷酸抗原作为刺激剂的扩增法(磷酸抗原法)。我们采用的固相化抗人TCRγδ抗体扩增法(抗体法)扩增的γδT细胞与磷酸抗原法所获细胞具有相似的细胞表型,在对淋巴瘤细胞的细胞毒活性上也没有明显差别。但是,与磷酸抗原法不同的是,抗体法扩增的γδT细胞中还包含Vδ1 T细胞亚群。实验结果表明,Vδ1T细胞亚群虽然与V62 T细胞亚群具有相似的细胞毒作用,但是其对淋巴瘤细胞和淋巴瘤组织表达的趋化因子CCL17和CCL22的趋向性显著优于Vδ2 T细胞亚群,提示抗体法较磷酸抗原法在扩增γδT细胞用于过继免疫治疗淋巴瘤方面更具优势。抗体扩增的γδT细胞在体外对多种淋巴瘤细胞具有良好的细胞毒作用,动物的体内实验进一步证明其回输体内后具有良好的抗淋巴瘤效果。固相化抗人TCRγδ抗体对12例来自淋巴瘤病人的外周血γδT细胞的成功扩增,进一步证实了该方法扩增的γδT细胞应用于淋巴瘤过继免疫治疗的可行性。严重急性呼吸综合症(Severer acute respiratory syndrome, SARS)是由冠状病毒家族新成员SARS相关冠状病毒(SARS associated coronavirus, SARS-CoV)感染引起的。SARS-CoV是一种单链RNA病毒,它的主要结构蛋白质分别为S蛋白(Spike protein)、E蛋白(Envelope protein)、M蛋白(Membrane protein)和N蛋白(Nucleocapsid protein),其中S和N两种结构蛋白是SARS-CoV主要的免疫原,也是本研究的主要研究对象。本课题组在前期研究中,利用合成的包含SARS-CoV主要结构蛋白的重叠肽库进行表位作图筛选,共筛选到了5条对恢复期SARS病人呈血清高交叉反应性的线性B细胞表位。将上述5条线性B细胞表位进行不同组合,并用柔性连接子(G4S)3进行连接,通过搭桥PCR方法和人工合成DNA方法获得了5个多表位肽(Poly-epitope peptide, PEP)编码基因片段,随后构建了原核表达载体。本研究中对重组多表位肽(Recombinant poly-epitope peptide, rPEP) rPEPl和rPEP2进行了原核表达；用Western blotting方法鉴定前期研究中利用重组多表位肽rPEPl和rPEP2免疫家兔制备的多克隆抗体：同时用病毒中和实验检测多克隆抗体中和SARS-CoV假病毒的效率。结果表明,rPEPl和rPEP2都具有较强的免疫原性和中和作用,为制备多表位肽疫苗提供了实验依据。